T7RNA 聚合酶系统基因表达实验
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简介
本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体T7 RNA聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于T7 RNA聚合酶启动子（PT7）的控制下。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。
对于大规模的工作，PT7 操纵的基因可以通过同源重组插入另一个重组痘苗病毒中，使之与 vTF7-3 共同感染悬浮细胞（见「两种重组痘苗病毒共感染细胞」）或感染 OST7-1 细胞(可以持续表达 T7 RNA 聚合酶的稳定细胞系；见「单病毒感染OST7-1细胞」）。表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定，用「离子交换层析实验」描述的方法纯化。
对痘苗病毒/T7 RNA聚合酶杂交表达系统有几种创新的方法，其中的一个新的改进是VOTE诱导的表达系统，它不需要应用两种重组病毒或特殊细胞系（见「利用VOTE系统」）。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
来源：丁香实验
操作方法
1. 对于贴壁培养的单层细胞：1.1 感染 CV-1 贴壁单层细胞：在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5 × 105 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养，直至细胞几乎汇片生长（一般过夜）。1.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶，涡旋混匀，温育 30 min，每隔 5～10 min 晃动一次。MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质
单病毒感染OST7-1细胞1. 用含有 400 μg/ml G418 的完全 MEM-10 培养基以 1 × 106 个 OST7-1 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养，直至细胞汇片生长（一般过夜）。含有 G418 的完全 MEM-10 培养基用于维持细胞培养，但 G418 在表达实验中并不需要。2. 混合等体积的病毒储液（10 pfu/细胞）和 0.25 mg/ml 胰酶，涡旋混匀。温育 30 min，每隔 5～10
利用VOTE系统1. PCR 扩增外源基因可读框，将含有翻译起始密码子作为 NcoI（CCAT- GG）位点一部分克隆到 pVOTE. 1 中或作为 NcoI（CATATG）位点的一部分克隆到 pVOTE. 2 中。PCR 产物的另一末端应该与 MCS（XhoI SacI, SmacI EcoRI, PstIl, SalI 或 BamHI）中单一的限制酶位点兼容。2. 选用限制性内切核酸酶消化 PCR 产物、pV
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