T7 DNA聚合酶测序技术

一、概述

T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于许多模板来说，使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。

T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应（Chase step）。然而对于有紧密二级结构的区域，错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。

T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。

T7 DNA聚合酶测序时DNA的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA片段。

二、材料

待测的DNA模板，可用双链或单链模板。

三、设备

高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X光片。

四、试剂

1、5×T7 DNA聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris·Cl，pH7.5，100mmol/L MgCl2，250mmol/L NaCl。

2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。

3、DTT：0.1mol/L。

4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

5、5×dITP标记混合物：15mmol/L dITP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

6、dNTP A溶液（适用于dGTP）：80mmol/L dGTP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCI。

7、ddG终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddGTP。

8、ddA终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddATP。

9、ddT终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddTTP。

10、ddC终止混合物（适用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddCTP。

11、dNTP B溶液（适用于dITP）：160mmol/L dITP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCl。

12、ddG终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。

13、ddA终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。

14、ddT终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。

15、ddC终止混合物（适用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。

16、测序用T7 DNA测序酶。

17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris·HCl，pH7.5，5mmol/L DTT，0.5mg/ml BSA 。

18、终止溶液：95%甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰。

19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP，35S的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000～1500Ci/mmol，10mCi/ml。

20、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.5。

21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。

22、X光显影液：H2O：50℃ 800ml，米吐尔 2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚 8.8g，无水NaCO3 48g，KBr 4g， 定容至1000ml备用。

23、F-5坚膜定影液：水600ml，Na2S2O3 240g，Na2SO3 15g，冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉状钾矾 15g ，定容至1000ml 备用。

24、TYP肉汁培养基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl，2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。

25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac储备液等体积混合。