下游纯化工艺简介

Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。

一、纯化工艺常用衔接技术：

1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。

2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。

3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。

4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。

5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。

6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。

7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。

8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。

9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。

10、过滤

澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）

二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介

chromatography，色谱，层析

表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理

方法	分离原理	基于
凝胶过滤（GF）	分子大小/形状	分子形态
离子交换色谱（IEX）	分子所带电荷	Asp、Glu、Lys、Arg、His等带电氨基酸
疏水作用色谱（HIC）	表面疏水性	Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸
金属螯合色谱（IMAC）	分子与金属形成配位键	His、Trp、Cys
亲和色谱	特异生物识别作用	抗原-抗体，酶-底物，酶-抑制剂等
共价结合色谱	共价结合	巯基（Cys）

1、纯化的一般目标和方法

首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。

然后进行捕获色谱（capture chromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。

经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediate chromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。

最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。

2、纯化前的准备工作

（1）样品稳定性试验

a、测定样品在pH 2-9的稳定性；

b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；

c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；

d、测定样品在4-40℃的稳定性；

e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。

（2）样品预处理

a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）

b、去除样品中脂类（10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提）

c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）

d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）

表 2 样品中有害杂质及去除办法

杂质	害处	预防措施
颗粒物	堵塞柱子	增大反压力  0.45-0.22微米膜过滤；10000 g 离心10-15分钟；细胞匀浆，4000-5000 g离心30分钟。
脂类	封闭介质配基、导致沉淀、导致非特异吸附	10000 g离心10-15分钟；若目标分子稳定，用有机溶剂抽提
核酸	高粘度、封闭介质结合位点	加入核酸酶消化，或使核酸沉淀
蛋白酶	降解目的蛋白  加入蛋白酶抑制剂	用亲和色谱除去蛋白酶；快速进行第一步分离；低温下进行分离；在蛋白酶缺陷的宿主中表达重组蛋白

由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：

表3 不同色谱方法对于样品的要求

样品参数	离子交换色谱	疏水作用色谱	凝胶过滤色谱
样品体积	无限制	无限制	一般柱体积的1-5%
样品量	最大理论载量的10-20%	最大理论载量的10-20%	仅受到样品粘度限制
样品粘度	约<50mg/ml	约<50mg/ml	约<50-100mg/ml
pH值／盐浓度	同平衡缓冲液（低盐）	同平衡缓冲液（高盐）	仅受介质与样品稳定性限制
有机溶剂	为减少非特异吸附,可加入有机溶剂(<30%)	分离后，可用有机溶剂进行清洗	仅受介质与样品稳定性限制

（3）样品的保存条件：

短期储存（小于24小时）

a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀

b、在密闭容器中冰箱冷藏

较长期储存（数天）

a、b、同上

c、加入适当的抑菌剂

长期储存

a、同上

b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。

3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立

a、目的蛋白含量测定

酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。

b、总蛋白含量测定

紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。

c、样品复杂度检测

HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。

4、蛋白质的来源

（1）天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。

（2）重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：

a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。

b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。

c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。

表4 不同来源的蛋白质样品概述

来源	目的蛋白含量	复杂度	杂质类型	色谱前预处理
天然	低	复杂	固体颗粒，杂蛋白，核酸，蛋白酶	去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
重组	较高	复杂	细胞碎片，宿主蛋白，核酸，蛋白酶	去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
包涵体	很高	低	主要为目的蛋白	高速离心分离，溶解、复性
外周质	高	中等	宿主蛋白，蛋白酶	去除固体颗粒
分泌	低	低	主要含培养基蛋白  培养基，蛋白酶，宿主蛋白	去除固体颗粒，抑制蛋白酶

三、常用液相色谱纯化方法

1、凝胶过滤（gel filtration，molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。

根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。

凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。

要点: 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。

以下为常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数

系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用

Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽

Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白

Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒

Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸

Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白

Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白

Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白

Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体

Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断

Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米 <20000bp的质粒、巨大多糖、病毒

Sepharose FF系列 Sepharose 6 FF 10000~4000000 45~165微米 质粒、病毒

Sepharose 4 FF 60000~20000000 45~165微米 病毒，rHBsAg等巨大分子

Sepharose xB（CL-xB）系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物

Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子

Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子

Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物

Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物

Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120

Sephadex G-15 小于1500 40-120

Sephadex G-25 coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用

Sephadex G-25 medium 1000-5000 50-150

Sephadex G-25 fine 1000-5000 20-80

Sephadex G-25 superfine 1000-5000 10-40

Sephadex G-50 coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离

Sephadex G-50 medium 1500-30000 50-150

Sephadex G-50 fine 1500-30000 20-80

Sephadex G-50 superfine 1500-30000 10-40

Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离

Sephadex G-75 superfine 3000-70000 10-40

Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离

Sephadex G-100 superfine 4000-100000 10-40

Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离

Sephadex G-150 superfine 5000-150000 10-40

Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离

Sephadex G-200 superfine 5000-250000 10-40

2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）

蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱

对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。

两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。

column chromatography（柱色谱）

batch chromatography（批色谱）

c、疏水作用色谱

利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。

d、亲和色谱

利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。

亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。

e、反相色谱

常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。

同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。

四、应用举例

例一、一种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab片断（E.coli中表达）

分子量：50 kD

等电点：11

表达定位：周质（periplasmic）

纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。

例二、重组表达的α-淀粉酶

分子量：49.2 kD；等电点：~6

先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。

例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离

1、史克公司：（酵母细胞表达）

破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换，超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。

2、Merck公司：（酵母细胞表达）

破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。

3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）

培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。

4、Below，M.Bioseparation.1(1991).397工艺

破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF，超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱。

例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离

（注射用降纤酶）

分子量：38 kD；等电点：~5.4

原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤

达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)

新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）

纯度达到98.5%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。

尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一条带，HPLC为单峰。

如上所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。