构建过表达载体菌液测序出现问题

因为通用性引物的特异性低，所以会出现重叠，更换引物再做

主要考虑以下几点原因：

1.有可能是基因重复，重复的两个拷贝之间有一个硷基的差异；

2.样品本身污染；

3.测序出现双峰（套峰）要根据具体情况来判断可能造成原因:

1）是单个碱基套峰还是很多，

2）是开始就套峰还是从某一特定位置（譬如插入位点）开始套峰。如果是单个碱基套峰，可能不是单克隆，也可能质粒在自己复制是就产生两中碱基；很多碱基套峰如果是开始就套峰，很可能是测序引物选择不好，不具有特异性，如果是在特定位置（譬如插入位点）开始套峰，非单克隆可能性很大。

4.不是一种克隆菌，需要从新划板，挑取单个菌落培养再测序。

这种情况很可能是由于PCR扩增过程中，通用引物与特异性引物共同扩增导致的。在构建过表达载体的过程中，常常使用通用引物对载体进行鉴定，而特异性引物则用于检测目标基因的表达情况。由于通用引物与特异性引物在PCR扩增过程中具有一定的交叉反应性，因此在测序时可能出现通用引物与特异性引物的重叠峰。

为了减少这种情况的发生，可以考虑在PCR扩增中使用更高特异性的引物，或者通过调整PCR反应条件来避免通用引物和特异性引物的共同扩增。例如，可以调整PCR反应温度和引物浓度，以使得通用引物和特异性引物的扩增效率有所不同。此外，在进行PCR扩增和测序时，需要注意样品的纯度和质量，以避免出现杂质和污染导致的假阳性结果。