质粒构建相关问题

没看懂你第二张图那个连接想表达什么意思。双酶切有问题那质粒肯定没构建对呀。如果可以确定之前回收的酶切后片段和载体没问题，就直接从连接再做一次，这是比较省时的办法。

无外乎2个关键点：1.载体和片段，载体在进行酶切时要切干净，做对照，单切一定要cip，不然切的好也是白搭；做连接转化时要做自连对照，看下转化子和自连的菌落数大概心里就有个概念连上没连上了；连接片段是酶切得来就可以直接连，把胶回收产物再跑个胶看看，有时候我觉得光测不是特别准，一般片段不会有特别大问题；2.连接体系，个人觉得一次连接那么费时间，可以适当拉开比例做几个连接，然后一起进行转化。

你的图是不是标错了？如果酶切没错的话，调整一下连接产物和感受态的比例。