怎么设计构建能产生出circRNA的质粒？

因其独特的首位相连结构，可以让其更不容易被核酸酶降解，有着比线性RNA分子更长的半衰期。现在主流认为circRNA形成主要有以下三种方式：A：侧翼内含子自身互补配对; B：RNA 结合蛋白驱动; C：mRNA 前体剪接时外显子跳读形成套索。第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，你可以根据实验目的选择

主要有2种构建方法：

a. 由于circRNA本身就能环化，所以将circRNA两侧的内含子序列充当环化臂进行构建；

b. 另外，也可以取一侧内含子序列1kb，另一 侧构建互补序列充当环化臂，最后检测circRNA的过表达效率，取最佳构建方式3。

不过，现在不用那么麻烦去检测哪种方式效率最高，直接把circRNA线性序列插入到商业化的circRNA过表达载体（带有环化臂）中，即可驱动环化实现过表达。

构建circRNA质粒首先要获取circRNA的目的序列，接着将两侧的侧翼序列延伸扩增，两侧加上酶切位点，插入相应的载体即可。载体构建成功后需要验证circRNA的成环。

circRNAs的形成不同于线性RNA的标准剪切模式，是通过backsplicing方式剪切而来。现有的circRNA形成模型主要以下几种：

（1）“lariat-driven circularization” 或者 “exon skipping”；

（2）“intron-pairing-driven circularization” 或者 “direct backsplicing”；

（3）环状内含子RNA(ciRNAs)形成模式；

（4）依赖于RBPs环化模式；

（5）类似于可变剪切的可变环化模式；