环状RNA（circRNA）序列查询及引物设计

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,也是RNA领域的研究热点。circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点,在细胞中充当miRNA分子海绵(miRNA sponge),可以解除miRNA对其靶基因的抑制作用。

在circRNA的研究中,设计出特异的circRNA引物极为关键。以下简介在circRNA的研究中,如何准确快速获得感兴趣circRNA序列并设计对应的环状RNA引物。

一、序列查询

如果已经知道circRNA的数据库ID,可以在circRNA数据库如:circBase中进行查找:

1.首先,进入circBase主页,http://circbase.org/,输入circRNA的ID。

2.点击Search,进入搜索结果,在结果界面中提供了circRNA的种属、染色体位置、ID、基因组中序列长度、剪接后RNA长度、文献等相关信息,点击FASTA

3.进入如下界面,选择spliced后点击最下方的search键。

4.即可下载FASTA格式的circRNA序列,下载的文件可以用记事本打开。

二、circRNA的引物设计

1.获得circRNA序列后。将3端的序列移置序列5端,进行序列转换。

转换前序列:

ATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTCAGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAG

转换后序列:

AGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAGATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTC

2.根据转换后的序列设计引物,引物设计可以使用Oligo、Primer等软件。

注意

①引物在剪接点2端,即PCR产物跨越剪接点;

②产物长度在100bp左右。

3.利用NCBI的primer blast工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)对设计的引物进行比对,比对结果应该显示引物无特异性扩增序列。

三、无circRNA编码(ID)

如果没有circRNA的编码(ID),也可以根据染色体位置查找circRNA的DNA序列。

1.首先进入UCSC或NCBI数据库(以UCSC数据库为例),网址:http://genome.ucsc.edu/,选择对应的基因组数据库。

2.进入基因组数据库后,在搜索栏中输入染色体位置,格式为:chr(染色体号):染色体位置1-染色体位置2

3.选择View下的DNA选项

4.计入如下界面,点击get DNA:

5.即可获得FASTA格式的DNA序列

6.根据文献或其他证据确定circRNA的剪接位点,在剪接位点下游选择150-200碱基转置到剪接位点上游的150-200碱基处。再按照“二”的方法进行引物设计即可。