我想问下关于circRNA环状特性鉴定实验

qPCR检测通过引物特异性和位点设计来保证所检测的为环状RNA，一般多用于高通量测序后的数据验证及后续功能研究的定量检测。Convergent引物作为参照，不管是基因组或线性RNA还是环状RNA均可扩增，而Divergent引物只有环状RNA可以被扩增出来。如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化）。

circRNA环状特性鉴定实验可以用converge primer和跨拼接位点的diverge primer加RNase R酶来鉴定。

1.RNase R消化检测 RNase R是一种来源于大肠杆菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化呈环形的RNA、套索结构或3’端突出末端少于7 nt的双链RNA分子。RNase R检测并非是必须的，但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和目的决定是否进行RNase R消化。RNase R并不是绝对的不能消化circRNA，消化时间过长、RNase R的用量过高都有可能会导致在酶消化后CircRNA的含量也有明显降低），所以在使用RNase R进行消化时，还要进行相应的预实验，设置好相应的对照，看是否对于所要研究的CircRNA有明显的影响，保证实验结果的准确性。

2.qPCR检测 qPCR检测通过引物特异性和位点设计来保证所检测的为环状RNA，一般多用于高通量测序后的数据验证及后续功能研究的定量检测。Convergent引物作为参照，不管是基因组或线性RNA还是环状RNA均可扩增，而Divergent引物只有环状RNA可以被扩增出来。 如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化）。

3.RNA-Seq检测 CircRNA可以通过RNA-seq技术进行大规模的鉴定，由于CircRNA在总RNA的含量占比比较低，为了增加CircRNA的检出种类和检出效果，一般会对CircRNA进行富集。富集的方法有很多种，大体上的原理都是通过技术手段去掉总RNA中不需要的RNA来达到富集的目的，比如使用RNase R消化总RNA、使用探针结合并去除核糖体RNA等。 进行RNA测序后，就可以使用生物信息学工具或方法在全基因组范围内鉴定circRNA。目前基于RNA-seq测序数据鉴定circRNA的方法主要是通过检测是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site来判断，即circRNA的首和尾连接处的序列