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做wb半定量为什么内参总是调不一致

相关实验:用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

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刹那芳华2333

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4 个回答

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未来9

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一:如果单独上样可以出现,可以排除蛋白本身的问题,但混合一起加时却跑的不齐,最大的可能就是胶的问题,胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。

二:就是抗体孵育问题,不知你是用孵育盒,还是用封膜孵育,一定要保证膜与抗体充分接触,保证孵育效果。

三是显影剂是预混还是混合好的,注意混合比例

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bamboopiggy

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1.调蛋白浓度要一批样品一起做。2.可能你选的内参不合适,换一个试试。

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府宅

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1.转膜的效率会不会是不一致的,一抗、二抗的接合GAPDH不好。都有可能。

2.因为WB中间的步骤太多,影响因素很多,但是还是可以控制一下的。

3.做过多次WB还是不行,建议新鲜制备蛋白样品。

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dxy_gwrp7ndq

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第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH。

第二,内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。

第三,PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起,一方面因为胶不好,样品扩散,另一方面蛋白表达量高,曝光时间长。

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