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qPCR(RT-PCR)数据相对定量的分析方法与经验

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验,也看了很多的资料,包括Nature protocol, AB官方的分析教程,MIQE,甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。 我在这里跟大家分享一下自己的经验,最常用,最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法,该法最最简单的说就是:首先将一次实验的所有基因Ct值整理好,之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct;换成公式就是:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因); 然后,将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好,整理进Excel,用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct,并同时对所有结果取相反数(就是加一个负运算,正数就变成负数,负数就变成正数),该步运算得到的结果就是-△△Ct。 最后,对-△△Ct进行2的幂运算,即2^-△△Ct就得出Fold Change。 但是,我想说的是2^-△△Ct得出的是Fold Change,不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因mRNA的情况,同时还具有放大效应,所谓放大就是本来A基因的-△△Ct得到为2,B

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利用实时定量PCR分析基因相对表达量

1.4. 2-△△CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。为了显示数据分析过程,我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过β-actin 均一化处理,我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在8h 的时间范围内,在每一时间点都取3 个重复样本,每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ,数据分析用到了公式9,即:Time x 表示任意时间点,Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。0 时刻目标基因和内标基因的平均CT(见图2 第8 栏)被用于公式9 中。通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数(见图2 第9 栏)。平均SD,CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法,在0 时刻的平均倍数变化接近于1。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与1偏差很大,则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。在前面的例子中,在每一

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qPCR常见问题及其分析

一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!4. 所有成分加完后,离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(现在已经是ABI的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检

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抑郁症动物模型构建装置介绍

慢性不可预知性温和应激致抑郁症动物模型抑郁症(depression)是一种伴随行为学改变、神经系统改变和其他生理病理变化的心身障碍性疾病,主要以 情绪低落、兴趣丧失、思维迟缓为主要特征,严重者有自杀念头及行为。慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)造模方法目前已被广泛应用于抑郁症研究,该方法造模所引起的模型动物病理生理改变与人类抑郁症相似。建模方法:1,慢性不可预 ...

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细胞培养的倍增和细胞培养的代数

细胞培养的倍增是培养物中细胞总数加倍,通常是指细胞指数或对数生长期。细胞培养的代数是指细胞群从培养瓶中移出,传代培养过程的次数,传代培养的目的是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。

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肿瘤细胞培养

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置,首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:(一)形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。(二)生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生长的因子,而癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能在低血清培养基

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表皮细胞培养

1.取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5~1平方厘米小块。2.EDTA 处理:先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。3.冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜。4.分离:取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5.温消化:取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60分钟。6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液。7.培养液:通过80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2温箱培养。

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细胞培养环境

1 实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁,空气清新,干燥和无烟尘. 细胞培养 室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室.2 常用设施及设备(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式,直流式和外流式三大类.(2)无菌操作间:一般由更衣间,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等.(3)操作间:普通培养箱,离心机,水浴锅,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等.(5)分析间:显微镜,计算机及打印机等.3 培养器皿常用 细胞培养 器皿有培养瓶,培养板,培养皿等.常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度好,无毒,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种.(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液,血清等液体,常用规格

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流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞凋亡的检测方法众多,流式细胞仪检测凋亡,是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此,具有其它方法无可比拟的优越性。下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。在凋亡诱导剂的作用下,首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体,线粒体的功能发生衰退;后是caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,这时细胞的形态已经发生了改变,可以看到细胞变小,胞核皱缩;最后是细胞内DNA断裂,形成凋亡小体。在凋亡发生的各个过程当中,都有相应的流式细胞仪的检测方法,可以采用以下检测方法:1、线粒体功能2、DNA Cycle3、Caspases4、Annexin V Assay5、DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期,对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒(产品编号为BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是:正常细胞中,染料可以在线粒体内聚集,发出明亮的红色荧光;而细胞凋亡后,其线粒体膜电位发生改变,染料无法进入线粒体,

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流式细胞术数据处理与分析

1. 单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形,可用来进行定性分析和定量分析。横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值,其单位用“道数”(channel)表示,横坐标可以是线性的,也可以是对数的。纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。下面以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方图所表达的信息。单参数直方图经DNA特异性染料(如P1)染色的细胞群体,通过流式细胞仪测量区受激光照射后发出特异性荧光,在一定条件下,荧光强度与细胞内的DNA含量成正比,DNA含量高的细胞发射的荧光强,反之则弱。DNA含量与细胞数目的关系,即2N(2倍体)代表GO/G1期细胞,4N(4倍体)代表G2/M期细胞,两者中间代表S期细胞。这是典型的以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图。通过上述信息可得到所测细胞群中增殖细胞的数量。2. 二维点图单参数直方图只能表明一个参数与细胞数量间的关系,不能显示两个独立参数与细胞数量的关系。当需要研究两个或更多测量参数之间的关系时,可采用二维点图。二维点图有两种形式,横坐标表示前向散射光(FSC),反映细胞的大小;纵坐标表示侧向散射光,反映细胞内颗粒的大小和多少。

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ELISA的原理及基本类型

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。进行检测时,样品中的受检物质(抗原或抗体)与固定的抗体或抗原结合。通过洗板除去非结合物,再加入酶标记的抗原或抗体,此时,能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物后显色,根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量,进行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的灵敏度。ELISA的基本类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂:1. 固相的抗原或抗体;2. 酶标记的抗原或抗体;3. 酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。1.

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流式细胞术的原理

待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液,在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室,排成单列的细胞,由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流,并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光,由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光;二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管,用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓(等高)图来表示。对细胞进行分选的原理是,由超声振荡器产生高频振荡,使流动室发生振动,把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴,有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前,光学系统已测定了它们的信号(代表细胞的性质),如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合,或者说,如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时,仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后,其中被选定细胞的液滴就带有电荷,而不被选定的细胞

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流式细胞术的学科应用

细胞生物学研究 流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的 DNA 含量,得出 DNA 含量分布曲线。例如,在测定 Hela 细胞 DNA 含量分布曲线上,第一个峰是含有 2CDNA 含量的 G1/G0(DNA合成前期/静止期)细胞,其次一个峰是 4CDNA 含量的 G2+M (DNA 合成后期+有丝分裂期) 细胞,从 2C~4C 间的区域为 S 期( DNA 合成期)细胞。采用绘图法或计算机拟合法可计算出细胞周期各时相细胞占整个细胞群体的百分数。用流式细胞术可进行多参数分析,即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光,或多种不同颜色的荧光。例如细胞经吖啶橙染色后,DNA 发绿色荧光,RNA 发红色荧光。测定这两种荧光就能同时得知一个细胞内的 DNA 和 RNA 含量。测定结果可用二维散点图或三维立体图表示。用这种方法可根据 DNA 和 RNA 含量而鉴别出 G0 与 G1、M 期和 G2 期细胞。用流式细胞术与液体闪烁技术相配合,还可求得细胞通过 G1、S 和 G2+M 期的时间 (T、Ts、T+M 及其变异系数。近年利用抗溴脱氧尿苷 (Brdu

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免疫荧光技术常见问题汇总

1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白,两者操作过程有哪些不同?参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的。2、问:近期要做免疫荧光双标,不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?参考见解:(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物,可以用来源于 rabbit 和 rat 的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的,如 donkey anti-rabbit-FITC(绿)和 donkey anti-rat-Tex-Red(红)。(2)可以两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好,背景比较清晰。(3)阳性对照可以用阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG,荧光标记物对照是 PBS+ 荧光标记物。(4)封闭血清与二抗来源动物一致,如 10% 的正常 donkey 血清。(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。3、问:本人拟做 Brdu 标记神经干细胞免疫荧光,二抗为 FITC 标记,想请教各位大侠:(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?(2)封片时是否用甘

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直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同

免疫荧光细胞化学方法的原理是根据抗原抗体反应的规律,把已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗原或抗体,然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。方法具体种类有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下,根据其形成复合物所发的荧光,来确定判断检测物的来源、性质和部位。1、直接法:这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体,染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育,使之直接与载玻片上的抗原结合,在荧光显微镜下直接观察,作出判断。该方法评价:简单易行、特异性高、快速方便,常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质,敏感性较差,效果有时不理想,目前较少作为更多方面的检测。2、间接法:该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价:由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。目前本法应用较广泛,只需制备一种种属荧光抗体,即可适用于多种第一抗体

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流式细胞术的概述与简史

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球,细菌,小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台,现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善,今天的流式细胞仪已经十分成熟,并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作用。流式细胞术 - 概述一种在液流系统中,快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开,以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术,是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展,为了满

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做 ChIP 的心得体会

做 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)已经几个月了,虽时间不长,但深刻体会细节决定成败,这里就把自己认为值得注意的细节总结如下:1、cell counting:尽量做到准确,会影响 input 结果。 2、cross link:甲醛的终浓度是 1%,这个基本所有的 protocol 上都会强调。3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的 tip 头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,后面的 sonication 就麻烦了。4、sonication:ChIP 中最重要的一部分,合适的条件要自己摸索,可以一次尝试不同次数的 sonication,然后建议采用 EZ-ChIP 上推荐的方法看看 sonication 的效果如何。 5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混匀,因为salmon sperm DNA 是很粘稠的物质,若不混匀,后面你会发现 beads的量不一样,自然也会影响实验的结果。 6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净,但最后一个要尽量吸干净,必要时可用 ge

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凝胶迁移实验(EMSA)实验方法

凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、实验原理EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发送互作。二、实验操作步骤1、实验前准备(1)合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组,如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等(2)样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量,实验中等量加入蛋白。(3)探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记,可以

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质粒 DNA 提取常见问题分析

1.加入 solution.III,经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实,有的漂浮在液面,有的贴在离心管壁上,一摇晃即破碎脱落下来?细菌的用量太少,导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀,因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组 DNA 的缠绕,沉淀就显得不结实。解决方法:将细菌的用量增加。 2.加入 soln.III,经 10 分钟离心后细菌沉淀怎么不结实,呈大块的水泡状,上清较少?(1)使用了过多的细菌,导致菌体未被有效裂解。解决方法:将细菌用量减半。(2)细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法:注意将细菌悬浮充分。(3)加 Solution III 后中和不充分。解决方法:如果细菌用量较多,请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。(4)Solution II 出现沉淀。解决方法:如果实验室内温度低于 15℃,使用试剂盒前请注意观察 Solution II 中是否出现沉淀。如果出现沉淀,请于 37℃ 水浴溶解沉淀后再使用。(5)Solution II 长时间暴露于空气中被 CO2 中和,导致菌体未能被有效裂解。解决方法

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做好 ChIP 的四个注意事项

染色质免疫沉淀 (ChIP) 用于检测细胞核中天然染色质内的蛋白质与 DNA 之间的相互作用。ChIP 实验首先需要将细胞固定,即将蛋白质与 DNA 相互作用交联固定到位。然后将染色质打断为片段,使用抗体对目的蛋白质以及与其结合的所有 DNA 进行免疫沉淀。最后,解交联,对沉淀 DNA 进行纯化。纯化的 DNA 可进行进一步的分析,如标准或实时 PCR、芯片或测序分析。这些实验对染色质的完整性、蛋白质表位的质量以及免疫沉淀抗体的特异性非常敏感。尤其当目标蛋白质与 DNA 相互作用极少发生或不稳定时,这些变量就更为关键。第 1 步 – 采用对照(实验严谨更可靠)虽然使用酶消化制备染色质,可以改善 ChIP 操作规程,但合理的对照和高度特异性的抗体也同样重要。在实验操作步骤中添加阳性和阴性对照抗体可确保分析正常进行且结果可靠。阳性对照许多市售的试剂盒附带 Rpb1(RNA 聚合酶 II 的最大亚基)的抗体,做为阳性对照抗体。但是,Rpb1 仅在活性转录位点结合,因此,如果要研究的位点是非活性位点,那么 Rpb1 实际上将作为阴性对照使用。CST 推荐使用 Histone H3 (D2B12

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