细胞污染防治的一些心得
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通过在论坛中和站友们的交流，我发现很多求助细胞的站友培养细胞时间并不长，部分站友甚至没有经过系统的培训，仅靠课本知识和少量指导就开始尝试培养细胞，在培养过程中难免遇到不少问题，最常见的便是细胞污染。本人从读研开始接触细胞培养到现在近十年，从最开始的向实验室师兄师姐学习，到后来工作后和其他同事之间相互交流，在细胞培养这块还略有心得，所以我就个人的经验谈下我是如何防治细胞污染的，希望能帮到大家。
无论新人还是老手，在细胞培养过程中都可能遇到细胞污染的情况。那对于细胞污染，个人觉得最重要的是预防，因为细胞一旦污染，想救是非常困难的，即便救活，细胞状态也会变差，进而影响实验结果，所以我这边先来讲讲如何预防。生物安全柜是细胞处理的主要场所，而培养箱是细胞生长的主要场所，所以细胞污染通常就发生在这两个地方。那么在使用生物安全柜和培养箱时如何做好预防措施呢？
首先，所有进入安全柜的东西都要尽可能保证无菌。如果实验室条件允许，那直接购买商品化的试剂和耗材是最稳妥的，例如Gibco、Hyclone的试剂，Eppendorf、Corning的耗材，这些大品牌的试剂和耗材一般只要是正品都可以保证无菌。如果试剂需要自己用干粉配制，那么在配制中需要严格按无菌操作进行。另外每次试剂配制量不宜过多，比如完全培养基建议以一到两周内用完为宜。试剂在分装时可以考虑再用针头式过滤器过滤一次，减少污染的可能性。如果所用移液器吸头是散装的，则注意在将吸头装入吸头盒时需要带手套，因为灭菌时无法完全去除吸头上可能粘附的油脂和其他杂质。
其次，安全柜每次使用前需要紫外照射30min灭菌，然后通风5min以上保证换气到位。每次处理细胞前应将实验需要的各种试剂、耗材备齐，尽量减少细胞处理过程中的来回走动。安全柜内的东西尽量摆放有序，具体可以根据个人使用习惯而定，如果站友使用的是公用安全柜，则可能需要使用前临时调整。以我个人为例，移液器和吸头盒放右手边，实验中常用试剂放右前方，废液缸放左前方，并保证和试剂有一定安全距离，右角放置培养皿，左角放置其他耗材。大致原则是尽量保证最常用的东西靠右，次常用的东西靠左，右边操作区域为洁净区，左边操作区域为非洁净区，左撇站友则相反。
然后，实验过程中所有试剂不用时需要盖上瓶盖，瓶盖打开时除了干净的吸头，其他任何东西都不要从瓶口的上方经过。如果使用培养皿培养细胞，则处理时不要长时间打开皿盖。如果站友所用吸头没有滤芯，那在使用时注意不要将试剂倒吸入移液器，如果倒吸的是培养基，极易成为细菌生长的温床。一把有菌的移液器可以轻松污染所有使用其处理过的细胞，所以一旦发生倒吸，要及时用酒精棉球擦去倒吸的试剂，有条件的站友建议使用带滤芯的吸头。由于使用安全柜的过程中手和前臂都要进入安全柜，所以有条件的站友可以准备一件细胞房专用无尘服，使用前装入布袋消毒后烘干，在细胞房中取出，非更换前不要穿出细胞房。没有条件的站友则可以准备一副袖套，每次用完后放安全柜中紫外消毒。无论是否穿戴无尘服或者袖套，实验过程中只要手出了安全柜，再进入前都需要用75%的酒精消毒。
最后，如果使用培养皿培养细胞，放入培养箱前摇匀时要轻柔，不要将培养基摇到皿盖和皿身的间隙中，这样在细胞生长时很容易污染。如果使用瓶盖没有气孔的细胞瓶培养细胞，放入培养箱前需要将瓶盖拧松半圈左右，保证瓶内外可以进行气体交换，注意不要拧太松，这样在细胞生长时也很容易污染，有条件的站友建议选择瓶盖有气孔的细胞瓶，这样放入培养箱前直接拧紧瓶盖即可。由于培养箱内的温度和湿度很高，所以最好定期用75%酒精擦拭培养箱消毒。培养箱里水槽中的水需要使用无菌水，不可以用自来水。
那么细胞如果还是不幸污染了又该怎么办呢？我把细胞污染分为早期污染和晚期污染两种情况，污染的具体判断方法可以看下我的帖子：新细胞污染鉴定。早期污染是细胞状态变差，但依旧能保持生长，显微镜下未见明显微生物或可见少量微生物。这种情况的话我们在换液时可以多用PBS洗几次，然后加入适合的抗生素，具体加什么抗生素可以看下我的帖子：细胞培养中常用抗生素小结。早期污染只要发现及时，处理得当，救回来的可能性还是很大的。晚期污染则是细胞形态发生明显改变，细胞停止生长，显微镜下可见大量微生物。这时候我建议大家及时清理掉相关细胞，以免污染其他细胞。在对安全柜和培养箱进行消毒后，再重新复苏早批次的细胞。细心的站友会发现，新细胞收到后，不应急于开展实验，而应该先小心培养，冻存一到两个批次的细胞后再开展实验，这样实验过程中如果细胞出现问题，可以有冻存细胞保证实验还能继续进行。
以上是我对细胞污染防治的一些心得，大家有问题可以跟帖，我看到会尽量回复。如果站友觉得这个帖子还不错，请点个关注给个赞，谢谢！
