细胞培养中的污染

常见的污染如下：

1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理

2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作

3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。

4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。

5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等

关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。

1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水。

2、超净台、取材、器材、培养液、培养瓶、操作等因素。

3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染。

4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

关于黑胶虫：根据平时的操作，我觉得“黑胶虫”有没有可能是以下操作细节方面的问题导致的呢？

1、有时候血清瓶或者培养瓶上用标记笔写的字没有擦掉就直接泡酸，字迹溶解后沉积在酸缸中浸泡的瓶子里冲洗不净。

2、过火的时候不小心碰到酒精灯的灯芯，粉尘飞进培养液内。

3、有的同学习惯将移液管塞棉花的一端在酒精灯上焚烧一下，灰烬飞进培养液内。

我的细胞污染探索。某天打开孵箱，看到我的L1210的培养瓶培养液又是黄黄的，觉得很不错，今天又可以传代了，可是在镜下一看，细胞虽然明显增加了，但并没有象以前那样长满，而且更让我心惊的是怎么出现了许多黑色的小点，杆状，而且好像在动来动去，翻转，旋转，在细胞很多的地方小点就少，而在细胞较少的地方小点就多，细胞的活力也没有以前好了，第一反应细菌污染，请实验室老师过来看，说不是细菌污染，这个点要比细菌的小黑点大的多，也好象不是霉菌，没有菌丝，没有常见的团壮的生长，肯定不对劲，但到底是什么，说不上来。最后，决定换液、洗涤、离心，换瓶，操作结束后镜下看黑点几乎看不到了，有点放下心来。

隔天后去看，培养液还和上面的一样，但镜下，那种东西又出来了，在细胞少的地方，几乎呈现出粗砂粒样，我欲哭无泪，知道可能不行了，郁闷的换液后，回家上网·搜，一个名词跳了出来：黑胶虫。黑色、杆状、运动、细胞不会很快死亡，这些描述简直惊人的一致，我确定了，我受到了黑胶虫的袭击。但黑胶虫是什么，由于网上说法不一，我决定探究一下。首先，培养液略黄，稍有浑浊，镜下观察，细胞还没有死，但是已经不长了，那种东西已经是铺天盖地了，满眼望去，尽是粗砂粒样，细胞好像成了一个个汪洋中的小岛。细胞涂片，送到化验室，革兰氏染色，不久电话回报怀疑－－真菌。第一反应不可能，亲自去了化验室，看到了片上一个个瓜子样的小点，染色呈黑色。