细胞培养中的黑胶虫污染问题的处理

我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点。但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及 D-hanks 液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。同时培养箱也有本实验室保存的 3t3 细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。后来还有从军科院过来的 Hela 细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。

一、黑胶虫的特点

1. 与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多。

2. 对抗生素无效。

3. 可能通过培养箱空气进行污染。

4. 单用培养液及血清培养没发现问题。

5. 换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容。“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。

“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候， 细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题。

二、关于黑胶虫是什么的讨论

1. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西(曾经有文献报道过)。

2. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法。

3. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。

4. 有人说是纳米级的细菌。

其他的特点：

1. 形态上有些像细菌，直径约在 0.5~1 微米。

2. 在 400X 倒置显微镜小，有典型的布朗运动(不规则的原地小距离抖动)。

3. 细胞内好像也有存在。

4. 但并不引起培养液混浊。

5. 时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡。

三、处理方式

1. 换好一点的血清(我觉着和血清的关系不大)。

2. 如果是贴壁细胞的话，可用无菌的 PBS 洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞(从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道)。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效!还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。

3. 换用进口的一次性塑料培养瓶。

4. 建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用 KMnO4 熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏。

5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。

6. 有材料称 minocycline 具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

黑胶虫很难根除，最好的办法就是舍弃并进行全面的熏蒸杀菌我们实验室也污染了一次，后来熏蒸了一个星期，换气也用了 1 个星期，后来就好了，期间我也用什么换血清等方法弄过，不过作用不大，过几天那个又多了。呵呵，还是彻底的消毒一次好啊。我养的人的肝细胞也出现类似上面楼主说的“黑胶虫”。自己的观察和楼主还是有点区别：我用条件培养基(不含血清和二抗)长期培养细胞，每两天就更换，新配的培养基。在培养一个星期就出现类似“黑胶虫”的东西。胞浆和上清中均有那种东西，换液以后好像澄清了一点，第二天又出现了，这东西对细胞的生长也有些影响，细胞有的脱落死掉了。因为培养时间不久，还不知道是细胞在培养的过程中本身的原因还是黑胶虫的的影响。可以肯定可以和细胞共生。奇怪的是：我在用含血清(PAA公司小牛血清)培养基作对照的六孔板中发现，那上清中却是澄清的，三个复孔也是澄清的。

1. 当时怀疑是我是不是没加二抗的原因，后在条件培养基中加入二抗以后，发觉效果还是不明显。

2. 怀疑是不是条件培养基本身就含有那东西，于是将一部分培养基也放入培养瓶中培养。也没发现有那东西。

最后个人的结论：

这种东西在可能本身就寄生于人和动物的细胞内。二抗对其效果不明显。血清中可能存在有一种物质可以抑制其生长。细胞离开特有的免疫环境，很多被抑制生长的，寄生于细胞内的生物就开始生长，这种情况类似于HIV感染引起的感染一样。至今也没什么办法解决，在和战友们的的交流和学习中找到对付这种黑胶虫的办法。

五、有关血清使用中的常见问题解答

数十年来我们始终面临的是同样的问题。因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：

1. 保存血清最好的办法？

我们建议血清应保存在 -5 ℃至-20 ℃。若你一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损？

我们建议您将血清从冷冻箱中取出后，先置于 2-8 ℃ 冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。