GUS报告基因的定性和定量检测
互联网
1047
一、GUS报告基因的定性检测
GUS能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS 染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。
1. GUS染色底物的配制
| 试剂名称 | 母液浓度 | 母液配制方法 | 工作液浓度 | 工作液配制方法 |
| 磷酸缓冲液（pH7.2） | 0.5 M | 将0.5 M Na2HPO4 和0.5 M NaH2PO4 混合 | 50 mM | 1 ml |
| Triton X-100 | 10% | 取10 ml Triton X-100溶于水，定容至100 ml | 0.1% | 0.1 ml |
| 铁氰化钾K3Fe(CN)6 | 100 mM | 将3.2924 g 铁氰化钾溶于水，定容至100 ml | 2 mM | 0.2 ml |
亚铁氰化钾 K4[Fe(CN)6] •3 H2O | 100 mM | 将4.2239 g 亚铁氰化钾溶于水，定容至100 ml | 2 mM | 0.2 ml |
| EDTA | 0.5 M | 将18.61 g Na2EDTA•2H20溶于水，调pH为8.0，定容至100 ml水 | 10 mM | 0.2 ml |
| X-Gluc | / | / | 2 mM | 10.4 mg |
| ddH2O | / | / | / | 定容至10 ml |
表1. GUS染色底物的配制
0.5 M NaH2PO4的配制方法：将7.800 g NaH2PO4溶于水，定容至100 ml。
0.5 M NaH2PO4的配制方法：将7.800 g NaH2PO4溶于水，定容至100 ml。
2. 染色步骤
（1）染色：加入适量配制好的GUS 染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6 h。
（2）漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
（3）脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
（4）记录：在体视显微镜下拍照记录。
二、GUS报导基因的定量检测
GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365 nm，发射波长为456 nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。
1.试剂配制
（1）1 mol/L Na2HPO4溶液：35.814 g Na2HPO4溶于100 ml水。
（2）1 mol/L NaH2PO4 溶液：15.601 g NaH2PO4 溶于100 ml水。
（3）0.1 M 磷酸缓冲液(pH7.0)：1 mol/L Na2HPO4取5.77 ml，1 mol/L NaH2PO4取4.23 ml，定容至100 ml。
（3）0.1 M 磷酸缓冲液(pH7.0)：1 mol/L Na2HPO4取5.77 ml，1 mol/L NaH2PO4取4.23 ml，定容至100 ml。
（5）0.5 M EDTA (pH8.0)：在80 ml 水中加入18.61 g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约需2 g 左右的固体NaOH），溶解后定容至100 ml。
（6）GUS酶提取液：0.1 M 磷酸缓冲液（pH7.0）取50 ml；10% SDS取1 ml； 0.5 M EDTA(pH8.0)取2 ml；Triton X-100取100 ul；β-巯基乙醇100 ul；用水定容至100 ml。
（7）MUG底物：称8.8 mg MUG，溶于10 ml GUS酶提取液中，配制成2 mmol/L 的工作浓度。
（8）反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12 g Na2CO3 ，用水定容到100 ml。
（9）考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg，95%乙醇5 ml，H3PO4 10 ml，定容至l00 ml，过滤后4℃保存。
（10）1 mg/ml BSA：20 mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20 ml。
2.植物总蛋白的提取
（1）取新鲜的植物组织100 mg 左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。
（2）将研磨破碎的组织转到EP管里，并立即加入1 ml 的GUS提取缓冲液，充分混匀。
（3）12 000 rpm，4℃离心5 min，将上清转至另一洁净的EP管，冰上放置待用。
3.蛋白浓度的测定（Bradford法）
（1）取7个EP管，分别加入0 μl、2 μl、4 μl、8 μl、12 μl、16 μl、20 μl 的BSA标准液，用水补至相同体积20 μl。加入980 μl 的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5 min。用紫外分光光度计测定595 nm 处的吸收值。以蛋白浓度（mg/ml）对吸收值A595做标准曲线。
（2）取待测蛋白样品10 μl，加10 μl 水，加入980 μl 的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5 min。用紫外分光光度计测定595 nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。
4. GUS表达水平的定量测定
（1）取100 μl 蛋白上清，加入400 μl 37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入500 μl MUG底物，37℃温浴。在0 min、15 min、30 min、45 min 和60 min 分别取混合反应物200 ul 加入到800 ul 反应终止液，室温避光保存。
（2）用荧光分光光度计在激发波长365 nm、发射波长455 nm下，狭缝10 nm 时测定不同时间点的荧光强度值。
（3）以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。
（4）用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。
