用于检测植物组织 RNA 的原位杂交法 （一）组织切片制备 l 植物组织的甲醛固定和包埋 1．将植物组织切成小块，立即放入一个装有10～50ml固定剂溶液的烧杯中，把烧杯放到真空脱水机内。调节真空度以形成一个温和的真空，然后慢慢恢复常压。微量便于固定剂渗入组织，必须反复真空和非真空状态。待固定剂充分渗入组织块后，室温下放置2～3小时。 2．室温下用50～100ml 50mmol/L PIPES缓冲液（pH6.8）漂洗组织块20分钟。 3．室温下将组织块先后放在不同稀释度的乙醇水溶液（25％，50％，75％和100％）中脱水。每个梯度取50～100ml，各培养20分钟。4℃下用50～100ml 100％乙醇培育组织块，脱水过夜。温和的摇动或搅动可以促进组织中溶剂的交换。 4．第二天上午，将组织块转移到50～100ml新的100％乙醇中。再脱水30分钟。 5．室温下用不同稀释度的二甲苯乙醇溶液（25％，50％，75％和100％）先后浸渗组织块。每个梯度取用50～100ml，各培育60分钟。在100％

确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网” l 双杂交和其他双成分系统 第一阶段：诱饵 -LexA 融合蛋白的鉴定 诱饵 -LexA 融合蛋白的构建 1． 将编码诱饵蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为 pBait 。 2． 采用下列 LexA 融合基因和 lexAop-lacZ 报道质粒的组合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌： a. pBait + pMW12 （活化测定） b. pSH17-4 + pMW12 （活化的阳性对照） c. pRFHM1 + pMW12 （活化的阴性对照） d. pBait + pJK101 （抑制 /DNA 结合测定） e. pRFHM1 + pJK101 （抑制的阳性对照）

　　 　　我们描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。 引言 　　通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。 　　要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和 用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还 要经

　 　　杂交反应的条件类似于传统的Southern或Northern杂交。具体的选择视研究目的而定，例如，进行多态性分析或杂交测序时，要求能够区分单个碱基的变异，所以需要较高的杂交严谨性；而用于表达谱检测的芯片为了提高检测的特异性、保证较高的灵敏度，需要较长的杂交时间，高的严谨性、高的样品浓度、较低的杂交温度等。同时，杂交反应还必需考虑反应液中的盐浓度、探针序列的G+C含量、探针所带电荷情况、探针与芯片片基间连接臂的长度及种类，靶序列二级结构等因素[1]。固定于芯片表面的探针或蛋白、多肽分子与位于液相的靶分子进行生化反应（作用）的过程不完全与液相中生化反应相同。其原因在于，生物大分子与固相支持物的结合导致了溶液中的靶分子与其不能迅速地发生作用，延长了反应时间，必要时还必需提高靶分子的浓度以加快反应。而且，固相化的大分子，特别是空间体积较小的分子，很容易受到支持物对生化反应的空间阻碍作用。如何解决以上问题是生物芯片技术应用中的关键之一。 有研究表明[2,3]，在探针分子与片基间加入适当长度的连接臂可使杂交效率提高上百倍。连接臂将固相化的探针分子与支持物隔开一定的距离，减少

1)什么是引物延伸实验？ 引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。 2)作这样一个实验必须用什么试剂？ 引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和电泳装置。所得结

1)什么是TNT偶联网织红细胞裂解物系统？ TNT偶联网织红细胞裂解物系统为研究人员提供了一种可供选择的真核体外翻译系统，一种单管、偶联转录/翻译系统。将转录产物掺入到翻译混合物中，TNT偶联网织红细胞裂解物系统简化了体外翻译的过程，缩短了翻译所需的时间。标准兔网织红细胞裂解物翻译系统所用的RNA来源于用SP6、T3、T7RNA聚合酶启动子在体外合成的转录产物，需要3次分开的反应，每1个反应间需要多个步骤。TNT偶联网织红细胞裂解物系统消除了多步操操作带来的得率低的问题。 2)TNT快速偶联转录/翻译系统和TNT偶联网织红细胞裂解物系统有何差别？ TNT偶联网织红细胞裂解物系统为研究人员提供了一种单管、偶联转录/翻译系统。TNT快速偶联转录/翻译系统将所有转录和翻译有关的组分，组合在TNT快速超级混合液中，简化了操作步骤，这些组分包括RNA聚合酶、核苷酸、盐、RNasin核酸酶抑制剂，研究人员只需加入模板和甲硫氨酸（一般是放射同位素标记）。相比而言，TNT快速偶联转录/翻译系统更方便（加样步骤少），无残留试剂。另外，镁和钾的浓度可作相应调整，以增加得率和翻

导论 质粒DNA的小量制备 质粒ＤＮＡ的大量制备 质粒ＤＮＡ的纯化 一、导论 　　已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA， 这些方法都含有以下3个步骤： 细菌培养物的生长。 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化。 （一）细菌培养物的生长 　　从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成

石蜡包埋组织的DNA提取 蜡包埋组织DNA提取的基本方法 影响DNA提取质量的因素 提高DNA提取质量的方法 　　近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对开矿学延伸。通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要， 结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与

连接反应 （一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 　　ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低

一、 组织和细胞总RNA提取： 异硫氰酸胍法（一）试剂准备 1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2 mM β-巯基乙醇。 2． 变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。3．2 M乙酸钠：pH 4.0。 4． 异丙醇5． 无水乙醇、70%乙醇6． 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 7．DEPC H2 O：100ml ddH2 O中，加入DEPC 0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。 （二）操作步骤1． 样品处理： （１）培养细胞：收集细胞1-2×107 ，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。 （２）组织：取1-2g组织（新鲜或

分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（tr

一、 酸杂交技术 检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。 杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般32P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已

从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。探针和靶的相互反应如抗原 - 抗体、血凝素 - 碳水化合物、亲合素 - 生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。此方法用于疾病的诊断，称为分子杂交基因诊断。此法开始用于遗传性疾病的诊断如血红蛋白病的诊断、先天性遗传病的产前诊断。近来，已发展为诊断外源性病原体如病毒、细菌、原虫等的方法；内源性病变基因研究如癌基因检测、基因突变、基因缺失或变异引起的疾病的基因诊断；人类基因识别及其生理功能和衰老有关研究；在法医检测中有关性别鉴别和 DNA 指纹谱的鉴定。基因探针的研究引起了人们高度重视，在探针的制备技术上有重大突破。可将核酸分子探针检测比喻为在柴草堆中去找一根针的神奇技术。据美国华尔街分析家预言： “ 在生物技术市场中，下一个突破和具有吸引力的是基因探针 ” 。它的巨大的开发潜力和经济效益，已引起人们的重视。 目前基因检测方法中以同位素标记（ 32P 、 35S 等） DNA 探针

一、实验目的 观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法。了解和掌握不同物种染色体组型和带型分析的方法和技术，进一步鉴别染色体结构和染色体组。要求至少利用一种方法制备出一个物种的合格的染色体标本，进行组型分析或进行不同的带型，如G-带、C-带等分析。练习显微摄影的操作过程，拍摄和印放显微照片。 二、实验条件 本实验在遗传学实验室完成。遗传学实验室提供： 1、实验仪器及用具 显微镜（附摄影装置），冰箱，恒温水浴锅，电子天平，容量瓶，试剂瓶烧杯，染色缸，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，玻璃板，滤纸，标签，铅笔 2、药品和试剂 冰醋酸，无水酒精，甲醇，盐酸，柠檬酸钠，氢氧化钡，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，甘油，Giemsa粉剂，果胶酶，纤维素酶 试剂1：Giemsa液：0.5克Giemsa，33ml甘油，33ml甲醇，用少量甘油将Giemsa粉末研磨至无颗粒，剩余甘油分次洗涤至棕色瓶内，置56℃恒温2h，加入甲醇，过滤后保存于棕色瓶中。 试剂2 ：5％氢氧化钡：5gBa(OH)2加入100ml沸蒸馏水中溶解后过滤

一、样品的浓缩 　　生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： 1、减压加温蒸发浓缩 　　通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化

在某些情况（例如用寡核苷酸作Southern印迹杂交的探针）下，重要的是要将寡核苷酸标记至尽可能高的放射性比活度。磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。但用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成与合成寡核苷酸互补的DNA链， 则可得到比活度更高探针（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射性标记探针。 该引物后在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，从而使[γ－32 P]dNTP在模板指导下发生掺入。反应后，通过对模板和产物进行变性继而通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳交将它们分开。用这种方法，有可能生成这样一种寡核苷酸探针，即每一寡核苷酸分子带有若干个放射性原子。其放射性比活度可高达2x1010 计数/（分．mg）。对该法进行改进后，可以由两段3'端含互补序列的寡核苷酸合成更长的探针（Ullrich等，1984a）。 在准备进行这些类型的反应时，务必考虑以下几点： （1） 反应中[α-32P]dNTP的比活度 α－磷酸已完全被32 P置换的

　电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983）， 但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。 1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。 2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出

合成的寡核苷酸在合成时其5'端缺少一个磷酸基， 因而极易用T4 噬菌体多核苷酸化反应，这种探针可达到于 γ＝ 32 P从[ γ＝ 32 P]ATP本身同样高的放射比活度。下面所述的反应是为对10pmol寡核苷酸进行高比活度的标记而设计的。通过扩大或缩小这一反应的规模便可成功地标记不同量的寡核苷酸，而各成分的浓度则可保持不变。 1） 配制下列反应混合液： 寡核苷酸（10pmol/ μl） 1.0 μl 10xT 4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2.0 μl [ γ＝ 32 P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0 μl水 11.4 μl 10xT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.1mol/L MgCl2 50mol/L 二硫苏糖醇(DTT) 1mol/L 盐酸亚清胺 1mol/L EDTA(pH8.0)充分混匀，在一装有10 μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反应管内加入0.5 μl上述反应混合液，搁置一旁留备步骤3）中使用。该反应所含[ γ

１．带有非互补突出端的片段 　　用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段，刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样，因而几乎总是能找到一种带有与外ＤＮＡ片段未匹配的限制切位点的载体。于是，采用所谓的定向克隆即可将外源ＤＮＡ片段插入到载体当中。例如：载体pUC19用BamHl和Hind－Ⅲ进行消化，然后，通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是，这一载体就可以同有与BamHl和ＨindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源ＤＮＡ区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌，检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补，载体片段不能有效地环化，所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此，大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源ＤＮＡ区段的质业，外源ＤＮＡ区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然，可以根据特定的外源ＤＮＡ区段来改变限制酶的组合方式。 　　如要制备定向克隆载体，它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制

　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决： １）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ片段的末端接上合成在接头或衔接头。 ２）在得到控制的反应条件下，用大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3'凹端的ＤＮＡ片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平反