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【共享】超高效电转化细胞的制备、电击及要点——经过实践检验可靠适用

最近做了四次电转化,两次成功转化率大于10的9次方,效果非常好 ;另从两次失败转化率吸取了教训;现将试验方案及操作与大家共享:1.细菌电转化感受态细胞的制备 (方案由李芃同学提供,lzf继承补充)1)由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落,过夜培养16-20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜,转速控制在180rpm。2)第二天,取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基(1 ...

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【原创】RNA提取的流毒非浅的经典误区(初学者的必看贴)

RNA提取的流毒非浅的经典误区(初学者的必看贴)最近碰到了好几个RNA提取的初学者来实验室学习如何提取RNA,对于如此简单的操作,却有如此多的人提取不出来,细问一下,原来他们的知识来源都是书本上或者网上的“RNA提取注意事项一类”的所谓经验,其实,他们提取不出来的真正原因,恰恰是他们严格遵守了所谓的经验,精力全放在不需要注意的地方,结果搞得自己很紧张, 真正需要注意的操作反而没有注意了。下面我就结合生物通上常见的R ...

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【旧帖整理】胶回收

最近在做连接的试验,由于需要多次纯化回收,而胶回收的回收率往往又很低,使得最后目的基因和载体的量非常低,电泳最后跑不出来,非常头疼,在dxy上也看到很多战友遇到这样的问题,于是对这方面的资料进行了整理,希望对大家有用,并希望各位战友继续对这一问题进行交流,补充,谢谢!!!整理的资料在附件中1.提高胶回收量的办法:1)增加电泳时的上样量。2)电泳缓冲液用新鲜配制的。3)切胶时尽量只切有条带的胶,减小切胶体积:含目的片断很 ...

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【交流】MICROARRAY入门教材

请注意发贴规则导言MICROARRAY,是固定在固体基片上的大量DAN序列的微阵列,是许多复杂核酸样本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具。日益引起人们兴趣的MICROARRAY,已经用于基因作图、变异分析和基因表达的检测,并且,有希望成为科学研究和临床应用的标准工具。从原理上和实践上,基因芯片都是已用于核酸定性、定量研究数十年的杂交方法(Southern blot、Northern blot、克隆杂交和点杂交)的 ...

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【原创】质粒DNA生产工艺的研究

随着核酸疫苗和基因治疗的迅速发展,高纯度的,符合药物动力学的质粒DNA的需求越来越大,本人准备的论文综述初稿,对目前大规模进行质粒DNA生产的流程有一些初步见解,与大家一起探讨。======================================================综述: 质粒DNA生产工艺的研究进展一、质粒DNA细菌质粒(plasmid)是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分,除了酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是一种 ...

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《分子克隆参考》编委会(暂定)

--------------------------------------------------------------------------------丁香园生物技术参考书供所有DXY战友使用分 子 克 隆 参 考主编 (暂缺)副主编 (暂缺)编辑 liven dqlover biowind wangjun2002274 biotin编者 (报名参加的战友,排名不分先后)zein第一章 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化第二章 基因组DNA的碱裂解法提取与纯化第六章 感受态细胞的制备newdragon第一章 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化y ...

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关于gateway 技术

gateway技术近两年开辟了高效克窿 转载新方法,特转载一篇于大家共赏,也欢迎更详细资料.GATEWAYTM克隆中基因看上去是什么样的?基因两端应该有att位点,在Entry克隆中是att L序列(100bp),而在表达克隆中是att B序列(25bp)。在att位点间的所有序列会和你的基因一起移动。因此,你必须预先决定是否包含诸如真核或原核翻译信号,或3'终止编码等DNA元件。我能克隆多大的片段?对于PCR产物,我们已经克 ...

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【旧帖整理】DNA的提取

作为分子生物学的工作者来说,DNA的提取几乎是我们每个人都要面对的工作,该工作看似简单,实则不然,当我们面对形形色色的组织样品,选择什么样的试剂以及什么样的方法能够获得最理想的结果,常常是我们每个实验工作者所要考虑的,现在我将园子里面出现过的有关DNA提取的有价值的一些帖子整理如下,希望能够对各位战友的实验科研工作提供一定的方便。1.线粒体DNA的提取http://www.dxy.cn/bbs/actions/ar ...

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【公告】核酸基因技术讨论版发贴注意事项&加分标准(修改稿)

欢迎来到《核酸基因技术讨论版》:本版归属于“实验技术讨论区”,以讨论各种以核酸基因为对象的理论和实验技术。本版的宗旨是为您提供各种核酸基因的相关理论和实践经验的交流平台!欢迎您参与交流!发贴必读&加分标准:1、本版欢迎0分站友参与讨论,加分特优。20分以下的战友,加分从优。2、对置顶的零回复帖进行回贴的战友,加分从快从优。3、对本版置顶帖子的讨论,或积极参与各位斑竹发起的各种活动,加分从优。对本版的建设提出任何意见或建议 ...

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【旧帖整理】RNAi

RNAi这个东西蛮新的,也是比较难理解的。所以做这个题目的整理工作难免闹笑话,请大家多多指正。今天,武汉的DXYer小聚一下,感谢lad莅临武汉促成了这次聚会。同时也感谢lad把召集的重任交给我。我更加感谢能来捧场的武汉朋友们。同时感谢对此次活动关注的朋友,我就不一一列举他们的名字了。我希望以这一帖送给所有的关心我、爱护我、教育过我、帮助过我的朋友。谢谢你们!(时间问题,我没有整理成超链形式,但并不影响大家检索,不好 ...

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染色体技术(1)

外周血培养基配制一、配制用水培养基的大部分是水,所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准,水的电阻应为200万欧姆,一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。二、培养基培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基,以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3(或HCl)调pH至7.2~7.4,若pH值超过7.6或远低于6.8,则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐 ...

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【旧帖整理】分子杂交(精彩内容等着你)

该贴内容较多,我花5天才整理成这个样子,但仅我一人之力,虽劳苦却难以求全,遗漏之处难以避免,请大家补充分子杂交分子杂交(综述)1、Southern杂交1-1、southern-blot protocolSOUTHERN BLOT PROTOCOL(English version)SOUTHERN BLOTTING操作手册DIG Application Manual非放射性的southern 杂交方法Southern转膜的方法Southern/ ...

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我收集的几个Northern杂交protocol(同位素,DIG,生物素等),供大家参考!

我也是从网上收集过来的,仅供相关人员参考!DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液:贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍,加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。工作液-在每50ml贮存液中加入0.3 ...

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【共享】“小”提质粒的“大”学问(转载)

复旦大学某教授写的有关质粒的好文,贴在这里与大家共享:从质粒抽提谈起碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了,几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因,我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研 ...

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【转帖】RNA 抽提之应知应会(转帖自生物谷)

RNA 抽提之应知应会背景介绍实验前方法/试剂的选择问题解答 (外源性污染导致的问题不在本解答考虑中)RNA 抽提的“三大纪律八项注意”Rnase 污染的10大来源RNase 和 DEPC 处理RNA 抽提的10大窍门提高 RNA 得率经典抽提小技巧特殊组织的抽提样品冻融的影响RNA 质量的判断RNAguard:使降解成为历史的试剂 背景介绍 对大部分实验人员来说,RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上,现有的 RNA 抽提方法/试剂,如果用于从培养细胞中抽提 RNA ...

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转载-网页方式下利用BLAST 程序进行基因/蛋白质序列比对

美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechology Information ,NCBI) 充分利用Internet ,为用户提供了丰富的生物信息资源。NCBI 的BLAST 程序是进行核酸序列和蛋白质序列相似性比较的优秀工具。1  BLAST简介NCBIBLAST(Basic Local Alignment Search Tool ,局部对比基本检索工具) 是将核酸序列或蛋白质序列与可用的序列数据库进行相似性比较的一系列程序。其核 ...

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【共享】PET重组质粒转化表达质粒中遇到的问题

晚上每天都有人做报告,我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的,但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的,我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的,一生研究T7噬菌体,也是T7 RNA polymerase induction system(pET系列质粒)的发明者。T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了 ...

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【转帖】Nature Biotech最新文章 我们如何应对海量的基因信息

我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时,却成为限制其广泛应用的一个障碍。1980年,英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖,至今已有近三十年了。在这三十年,DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。在过去几年,应用极 ...

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好多PCR形式,大家学习学习

第五节 PCR各处应用模式  一、兼并引物(Degenerate Primer)PCR  密码子具有兼并性,如表22-4,单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的,但可以设计成对兼并引物,扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变,但核苷酸的数量应相同。兼并度越低,产物特异性越强,设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸,并避免引物3’末端兼并,针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序 ...

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【共享】RNAi及其应用的研究进展

1998年Andrew Fire等首次发现并命名了RNA干扰(RNA interference,RNAi)。RNA干扰是指在真核细胞中引入双链RNA(double-stranded RNA)分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默(gene silencing)的现象。属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。该技术的出现为功能基因组学、基因治疗学、药物开发等 ...

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