Promega试剂盒抽提质粒遇到困难，紧急求教高手！
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按一下步骤操作，连续两次均抽不出任何东西，请高手指点！
抽提用作转染的重组质粒DNA(用5ml菌液)
所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。具体操作步骤如下：
（1） 将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。
（2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬。
（3）加入250µl细胞溶解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。室温孵育5min。
（4）加入350µl中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。
（5）室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1.5 ml 离心管，再次离心20 min，将上清移至新离心管。
（6）彻底摇匀除内毒素树脂，加50µl到离心管中，室温孵育10 min，在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。
（7）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，吸取上清至新离心管，弃去沉淀。
（8）加入200 µl GTC（5M/L），与上步分离的上清剧烈振荡混和。如果GTC产生沉淀，37℃加温10min，冷却到25℃使用。
（9）彻底重悬磁珠，加150 µl至溶液中，剧烈振荡混和，室温孵育2～3 min。
（10）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（11）将离心管从磁架上取出，加入200 µl 4/40洗脱液。剧烈振荡15sec 重悬磁珠微粒。4/40洗脱液可以去除无关蛋白，如核酸酶。
（12）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（13）将离心管从磁架上取出，加入1.0 ml 80％乙醇洗涤微粒。剧烈振荡10sec，将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（14）重复操作步骤（13）两次。
（15）洗涤完最后一遍后，打开离心管盖，放置在磁珠分离架10min，去除残余液体。
（16）将离心管从磁架上取出，加入240 µl 去离子水，振荡10sec，在室温孵育1min。将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置3 min后，将上清小心移至新离心管中。14000g离心10min，上清移至新管中，同时计算上清体积。
（17）加入0.5体积醋酸铵（7.5M/L）和2.5体积95％乙醇，混匀后室温下14000×g离心15 min。小心吸出上清，用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，室温下14000×g离心5 min。小心吸去上清，空气中干燥5 min，用30 µl去离子水溶解。
（18）分别取1ul，2ul，3ul反应产物电泳，估计质粒浓度。
（19）用分光光度计测OD值及核酸浓度。
抽提用作转染的重组质粒DNA(用5ml菌液)
所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。具体操作步骤如下：
（1） 将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。
（2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬。
（3）加入250µl细胞溶解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。室温孵育5min。
（4）加入350µl中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。
（5）室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1.5 ml 离心管，再次离心20 min，将上清移至新离心管。
（6）彻底摇匀除内毒素树脂，加50µl到离心管中，室温孵育10 min，在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。
（7）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，吸取上清至新离心管，弃去沉淀。
（8）加入200 µl GTC（5M/L），与上步分离的上清剧烈振荡混和。如果GTC产生沉淀，37℃加温10min，冷却到25℃使用。
（9）彻底重悬磁珠，加150 µl至溶液中，剧烈振荡混和，室温孵育2～3 min。
（10）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（11）将离心管从磁架上取出，加入200 µl 4/40洗脱液。剧烈振荡15sec 重悬磁珠微粒。4/40洗脱液可以去除无关蛋白，如核酸酶。
（12）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（13）将离心管从磁架上取出，加入1.0 ml 80％乙醇洗涤微粒。剧烈振荡10sec，将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（14）重复操作步骤（13）两次。
（15）洗涤完最后一遍后，打开离心管盖，放置在磁珠分离架10min，去除残余液体。
（16）将离心管从磁架上取出，加入240 µl 去离子水，振荡10sec，在室温孵育1min。将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置3 min后，将上清小心移至新离心管中。14000g离心10min，上清移至新管中，同时计算上清体积。
（17）加入0.5体积醋酸铵（7.5M/L）和2.5体积95％乙醇，混匀后室温下14000×g离心15 min。小心吸出上清，用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，室温下14000×g离心5 min。小心吸去上清，空气中干燥5 min，用30 µl去离子水溶解。
（18）分别取1ul，2ul，3ul反应产物电泳，估计质粒浓度。
（19）用分光光度计测OD值及核酸浓度。
