【共享与讨论】全基因表达谱差异研究方法
丁香园论坛
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全基因表达谱差异研究有这些方法，EST测序（成本巨大）、DDPCR（特异性差，基本已经不用）、基因芯片（技术上比较复杂，数据处理工作量大）、SAGE技术（相对较科学，实验数据较可靠、花费较大）等。
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cDNA-AFLP是从AFLP (amplified fragment length polymorphism) 衍生而来的RNA指纹识别技术，现已发展成较为成熟的转录组研究技术（Donson, et al., 2002），运用该技术可从转录水平鉴定mRNA差异从而阐明基因调控在RNA水平的表现。在此之前，鉴定和克隆差异表达基因（Differentially Expressed gene）的方法有RAP-PCR（RNA-fingerprinting by arbitrarily primed PCR，Welsh et al., 1992）和差异展示技术（DD/RT-PCR，Liang, 1992）等RNA指纹识别技术，但是，由于这些方法得出的实验结果存在高的“假阳性”、重复性差和难于检测低丰度表达的mRNA等缺点，所以经常要改进引物设计或者结合其他方法来做mRNA指纹图谱（Diachenko et al., 1996，Kato, 1996）。尽管如此，鉴定某一特定基因片断的不确定性和重复性差等致命弱点限制了这些方法的进一步发展。1996年Bachem和Money两个研究小组发明了cDNA-AFLP技术，它很好的克服了以上方法的各种缺点，而且操作也非常简便迅速（Bachem et al., 1996；Money et al., 1996）。
cDNA-AFLP技术主要包括四个步骤：1）、以poly-dT寡核苷酸为引物合成cDNA；2）、用两个限制性内切酶如BstYI、MseI酶切双链cDNA，然后在两端接上人工接头作为预扩增的模板；3）、设计与接头和酶切位点互补的引物，以此进行预扩增；4）、引物3’末端加2～3个选择性碱基进行选择性扩增，扩增产物在测序胶上可显示信息丰富的转录衍生片断（transcript-derived fragments，TDF）。从实验步骤可看出，引物设计至关重要。引物的序列一般为16～20碱基，可以分为三个部分：与接头互补的5’端核心序列、限制性内切酶位点序列、3’端选择性碱基。为防止双链的形成，5’端核心序列通常以G开始；3’端每加入一个选择性的碱基，扩增的带数就减少4倍，因此加入选择性碱基能选择到一套专一性的限制片断来扩增。但是，3’端加入的碱基数一般增加到3个选择性碱基，就足以去除其扩增非目标条带，否则引物与模板的错配率增加导致扩增特异性下降（Vos, et al., 1995）。
未完待续
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cDNA-AFLP是从AFLP (amplified fragment length polymorphism) 衍生而来的RNA指纹识别技术，现已发展成较为成熟的转录组研究技术（Donson, et al., 2002），运用该技术可从转录水平鉴定mRNA差异从而阐明基因调控在RNA水平的表现。在此之前，鉴定和克隆差异表达基因（Differentially Expressed gene）的方法有RAP-PCR（RNA-fingerprinting by arbitrarily primed PCR，Welsh et al., 1992）和差异展示技术（DD/RT-PCR，Liang, 1992）等RNA指纹识别技术，但是，由于这些方法得出的实验结果存在高的“假阳性”、重复性差和难于检测低丰度表达的mRNA等缺点，所以经常要改进引物设计或者结合其他方法来做mRNA指纹图谱（Diachenko et al., 1996，Kato, 1996）。尽管如此，鉴定某一特定基因片断的不确定性和重复性差等致命弱点限制了这些方法的进一步发展。1996年Bachem和Money两个研究小组发明了cDNA-AFLP技术，它很好的克服了以上方法的各种缺点，而且操作也非常简便迅速（Bachem et al., 1996；Money et al., 1996）。
cDNA-AFLP技术主要包括四个步骤：1）、以poly-dT寡核苷酸为引物合成cDNA；2）、用两个限制性内切酶如BstYI、MseI酶切双链cDNA，然后在两端接上人工接头作为预扩增的模板；3）、设计与接头和酶切位点互补的引物，以此进行预扩增；4）、引物3’末端加2～3个选择性碱基进行选择性扩增，扩增产物在测序胶上可显示信息丰富的转录衍生片断（transcript-derived fragments，TDF）。从实验步骤可看出，引物设计至关重要。引物的序列一般为16～20碱基，可以分为三个部分：与接头互补的5’端核心序列、限制性内切酶位点序列、3’端选择性碱基。为防止双链的形成，5’端核心序列通常以G开始；3’端每加入一个选择性的碱基，扩增的带数就减少4倍，因此加入选择性碱基能选择到一套专一性的限制片断来扩增。但是，3’端加入的碱基数一般增加到3个选择性碱基，就足以去除其扩增非目标条带，否则引物与模板的错配率增加导致扩增特异性下降（Vos, et al., 1995）。
未完待续
