【共享】超高效电转化细胞的制备、电击及要点——经过实践检验可靠适用
丁香园
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最近做了四次电转化，两次成功转化率大于10的9次方，效果非常好 ；另从两次失败转化率吸取了教训；现将试验方案及操作与大家共享：
1.细菌电转化感受态细胞的制备 （方案由李芃同学提供，lzf继承补充）
1）由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落，过夜培养16－20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜，转速控制在180rpm。
2）第二天，取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基（1：200）的500mL摇瓶中，37℃剧烈振荡 （300rpm）培养至OD600约为0.72-0.76，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。
3）用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体，弃上清。
4）用预冷的水（纯净双蒸水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃ 2200g离心10分钟，弃上清。
5）再用10%甘油重复步骤4）两次，2400g离心10分钟，最后一次倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100ul/支（一般，25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮）。
6）放入液N2中速冻，保存于－70℃。
注意
1） 菌种最好是－70℃冻存的，活化后生长状态较好。
2） 2ml培养过夜，震荡速度不要过高（一般应该是37度，300rpm，6hr，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在180rpm, 可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）
3） 培养完毕后一定要骤冷，使培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇动瓶子，大约10分钟。
4）所使用得器皿一定要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测。
5）培养完毕后得离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。
6）整个过程尽量不要用枪吹打。
7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配制。
8）控制好菌体的OD600值，我用JM109操作时值为0.727和0.757时都获得非常高效的转化率。而0.83时转化率明显降低。根据季节不同JM109达到相应OD值
所需时间有所差异2.5hr-3hr45min。
9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩200uL左右。切务用过多甘油液悬浮细胞，我曾用350-500uL10％甘油/25mL出发菌液，导致细胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。
2.电转化protocol（方案由李芃同学提供，lzf继承）
1） 将电击杯冰上预冷 ，冻存的感受态细胞取出冰上融解
2） 30ul感受态细胞，加入1ul纯化的连接液（或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液），冰上放置60s－90s
3） 将混合液加入预冷的电击杯， 注意擦干杯外的水，防止电火花
4） 3kv，200欧姆，25uF（我们用的是BioRad 电转化仪，0.2电转化杯），时间常数应该在4.5－5ms之间（其值越大，说明感受态细胞中离子去除越彻底。） 电击
5） 加入1ml 37度保温的SOC，将混和液洗出，此步有热击的作用，室温进行
6） 37度震荡培养1－1.5hr，可适当延长时间，使其充分表达抗性
7） 涂板
注意，
1） 电击之前保持低温状态。
2） 连接液要纯化，去除离子，ddH2O溶；或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液，切务过多以免电火花，我曾试过0.3uL和0.6uL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当。
3） 原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择
4） 电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70％乙醇浸泡，4度存放，使用前烘干即可。或者烘干后，-20度冰箱存放。
5）37度震荡培养时间切务过长，否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。我曾培养1hr45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰。
试剂配制（重蒸水配制）：
SOB：2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.05％NaCl完全溶解搅匀，加入2.5mMKCl 并用NaOH调PH7.0，灭菌后加入过滤除菌的MgCl2备用；
实际配制100mL时：2g bacto－trptone、0.5g bacto－yeast extract、0.05g NaCl完全溶加0.0186g KCl，10N NaOH一小滴即可调至PH7.0 分装入50mL培养基/500mL瓶高压灭菌；此后50mL中加入250uL 2M MgCl2即为SOB培养基；
SOC：50mL无菌SOB培养基+1mL 1M 过滤除菌的葡萄糖即为SOC，分装1mL每管，冻存于-20备用。
10％甘油：用分子生物学级别的甘油。
以上共享，希望有心得的战友们补充校正，谢谢！:-D
1.细菌电转化感受态细胞的制备 （方案由李芃同学提供，lzf继承补充）
1）由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落，过夜培养16－20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜，转速控制在180rpm。
2）第二天，取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基（1：200）的500mL摇瓶中，37℃剧烈振荡 （300rpm）培养至OD600约为0.72-0.76，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。
3）用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体，弃上清。
4）用预冷的水（纯净双蒸水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃ 2200g离心10分钟，弃上清。
5）再用10%甘油重复步骤4）两次，2400g离心10分钟，最后一次倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100ul/支（一般，25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮）。
6）放入液N2中速冻，保存于－70℃。
注意
1） 菌种最好是－70℃冻存的，活化后生长状态较好。
2） 2ml培养过夜，震荡速度不要过高（一般应该是37度，300rpm，6hr，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在180rpm, 可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）
3） 培养完毕后一定要骤冷，使培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇动瓶子，大约10分钟。
4）所使用得器皿一定要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测。
5）培养完毕后得离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。
6）整个过程尽量不要用枪吹打。
7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配制。
8）控制好菌体的OD600值，我用JM109操作时值为0.727和0.757时都获得非常高效的转化率。而0.83时转化率明显降低。根据季节不同JM109达到相应OD值
所需时间有所差异2.5hr-3hr45min。
9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩200uL左右。切务用过多甘油液悬浮细胞，我曾用350-500uL10％甘油/25mL出发菌液，导致细胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。
2.电转化protocol（方案由李芃同学提供，lzf继承）
1） 将电击杯冰上预冷 ，冻存的感受态细胞取出冰上融解
2） 30ul感受态细胞，加入1ul纯化的连接液（或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液），冰上放置60s－90s
3） 将混合液加入预冷的电击杯， 注意擦干杯外的水，防止电火花
4） 3kv，200欧姆，25uF（我们用的是BioRad 电转化仪，0.2电转化杯），时间常数应该在4.5－5ms之间（其值越大，说明感受态细胞中离子去除越彻底。） 电击
5） 加入1ml 37度保温的SOC，将混和液洗出，此步有热击的作用，室温进行
6） 37度震荡培养1－1.5hr，可适当延长时间，使其充分表达抗性
7） 涂板
注意，
1） 电击之前保持低温状态。
2） 连接液要纯化，去除离子，ddH2O溶；或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液，切务过多以免电火花，我曾试过0.3uL和0.6uL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当。
3） 原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择
4） 电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70％乙醇浸泡，4度存放，使用前烘干即可。或者烘干后，-20度冰箱存放。
5）37度震荡培养时间切务过长，否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。我曾培养1hr45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰。
试剂配制（重蒸水配制）：
SOB：2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.05％NaCl完全溶解搅匀，加入2.5mMKCl 并用NaOH调PH7.0，灭菌后加入过滤除菌的MgCl2备用；
实际配制100mL时：2g bacto－trptone、0.5g bacto－yeast extract、0.05g NaCl完全溶加0.0186g KCl，10N NaOH一小滴即可调至PH7.0 分装入50mL培养基/500mL瓶高压灭菌；此后50mL中加入250uL 2M MgCl2即为SOB培养基；
SOC：50mL无菌SOB培养基+1mL 1M 过滤除菌的葡萄糖即为SOC，分装1mL每管，冻存于-20备用。
10％甘油：用分子生物学级别的甘油。
以上共享，希望有心得的战友们补充校正，谢谢！:-D
