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[分享]PCR引物设计的11条黄金法则

最近也要开始做RT-PCR了,关于引物设计,在丁香园学到了不少东西,另外,在外网也查到一些设计引物的方法,于是就把这些知识总结了一下,希望对大家有所帮助。谢谢各位老战友的帮助!PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就 ...

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痛不欲生之RT-PCR2

前面说到:请教各位前辈,我做RT-PCR做到悲痛欲绝,肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA,RNA电泳3条带清晰,比例均可。测RNA浓度,在0.5到3之间,用AMV及随机引物,37度1小时做RT, 以GAPDH(鼎国,400多BP)为内参做PCR,目的基因片段为584BP,反复做,目的基因及内参均未扩出,但可见引物二聚体,请问,那一步出问题?RT还是PCR?是否要换用MMLV(但MMLV扩长片段,我的基因是一短 ...

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【原创】评 《我做PCR一年的总结,或许对各位XDJM有用》

今天到PCR技术讨论版逛逛,看到pgming2004的精华原创贴,下载附件后读了一遍佩服楼主善于总结的同时也想补充一点个人不同的看法。RNA 抽提(RNA Extraction)原文:三,抽提步骤1. 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。2. 分离阶 ...

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PCR相关软件下载

1. primer Premier 5.0 Demo2.8M。序列分析与引物设计,非常棒的一个软件。http://www.mirror.ac.cn/biosoft/down/PP500Installer.exe2. Oligo 6.65 Demo2.7M,引物分析著名软件,主要应用于核酸序列引物分析设计软件,同时计算核酸序列的杂交温度(Tm)和理论预测序列二级结构。http://www.mirror.ac.cn/biosoft/down/oli6instal ...

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【分享】PCR常见问题总汇

PCR常见问题总汇PCR产物的电泳检测时间  一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性,不出现扩增条带  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底 ...

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从头开始学习:聚合酶链反 应(PCR)(1)

聚合酶链反 应(PCR)方舟子  聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR,是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。【开发史】  这项技术的发明人是Kary Mullis。1983年,在一家生物高技术公司(Cetus)工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题,有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上,灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法, ...

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【原创】细胞RT-PCR的经验(偏向RNA提取)

做RT也做了几次,有成功也有失败,在园子中受益良多,把我自已的一个流程放上来,供大家参考.细胞RT-PCR操作流程实验流程一 、取RNA:1、处理细胞:(1)贴壁细胞:先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞两次,弃尽PBS后,直接向培养瓶中加入1ml Trizol,通过溶解细胞,通过移液管分次移出细胞裂解物。当Trizol量不足,可导致RNA中有DNA污染。(2)悬浮细胞:先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞,通过离心沉淀细胞,在 ...

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【分享】我整理的PCR资料.供大家分享.

请规范发贴,分享贴请在标题前加【分享】,谢谢您的合作。——by 草根我整理的PCR资料.供大家分享.PCR实验技巧增加PCR的特异性:1. prime理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或 ...

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RT-PCR常见问题答疑解惑

问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑 ...

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【分享】qRT-PCR实用指南(基因沉默编辑版)

实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反 ...

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【心得】如何做成为PCR高手

PCR 的问题,无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来,与大家共同讨论,希望对大家能有所帮助。。一、 引物设计所谓“工欲善其事,必先利其器”,这年头手工设计引物的人似乎不多,还是用软件方便些,防止你一不小心看走眼,丢一个碱基,同时计算起来也方便。设计软件有很多,既可以在线设计如Primer3.,http://frodo.wi.mit.edu/也可以用Primer5、Oligo6.0等等。到哪找?别着急,咱论坛 ...

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实时荧光PCR检测技术

实时荧光PCR检测技术众所周知,PCR(聚合酶链反应)技术自从1985年问世以来,经过十几年的发展,已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段,是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法,核酸诊断是分子水平上的诊断技术,可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷,比如,核酸诊断能直接揭示病原体的存在,能客观反映病原体在人体内感染及活动情况,可以作为临床治疗中的一个有效监控手段,另外采用核酸诊 ...

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RT-PCR经验浅谈二

很抱歉,这阵子忙了好久,没有时间来写后续的部分。因为第一次写的时候承诺过继续写下去的 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323830&sty=3 希望没有让等待的战友太失望。言归正传:这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题,在一般的逆转录反应中,较常用的是MMLV(鼠源的)和AMV(禽源的)两种,现在更有各家公司推出的耐热的(50-60度)、超长片段的逆转录酶,这方面具有专长的数gib ...

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【原创】RT-PCR相关问题专贴

为了方便大家系统理解操作RT-PCR,开个帖子,把有关有RT-PCR相关的问题一起统一回答.如果有重复的问题,或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。现在将每一页的主要问题整理一下1. RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2. 植物组织RNA提取的难点及对策3. 如何确定RNA质量的经验谈4. RNA提取常见问题分析RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国 ...

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【转帖】PCR常见问题总汇

PCR常见问题总汇  PCR产物的电泳检测时间  一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性,不出现扩增条带  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在 ...

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【原创】琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶的制备1、 取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。2、 胶液的制备:称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好 ...

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【旧贴整理】花了2星期系统归纳关于电泳的各位老师旧帖,与大家分享 --电泳

一 问题与解决大片段DNA的电泳问题一个含有8KB,16KB,20KBDNA的样品,需要跑琼脂糖电泳分离、鉴定和回收,请问:1、用0.5%的胶行不行? 2、用什么样的MARKER,从哪里可以买到?1)最好用低熔点的胶了,但是回收的盒子可要选好的,片断太大了,回收的效率不高,0.5%的胶很嫩的,要小心。实在不行可以用0.7%的,30伏左右低电压,最好把电泳槽放在冰箱里,低温下电泳.这种大小的DNA根本无需0.5%的凝胶,用1%即可。DNA ...

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【转帖】琼脂糖电泳步骤琼脂糖电泳步骤

琼脂糖电泳步骤之超级基础篇----对论坛的一些帖子和个人的看法做个汇总,欢迎大家多多指正。一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染,减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽,根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良,确保buffer的缓冲能力,减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或 ...

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【分享】MSP(甲基化特异性PCR)介绍

甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法.MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,最后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高,应用范围广。MSP 实验流程: 抽提基因 ...

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提取RNA需要在冰上操作吗?

刚才看到一个老兄讲到提高RNA浓度的方法,认为与离心的速度有关,其实不然.本人提的组织RNA的浓度,OD260/280值都在1.8-1.95之间,其中在相分离时上清吸取时不要吸到下一层很重要.本人现贴上TRIZOL说明书的RNA操作步骤,其中本人根据实验室的经验加以补充,供各位参考.Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂:氯仿异丙醇75%乙醇(in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液 ...

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