痛不欲生之RT-PCR2
丁香园论坛
前面说到:
请教各位前辈,我做RT-PCR做到悲痛欲绝,肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA,RNA电泳3条带清晰,比例均可。测RNA浓度,在0.5到3之间,用AMV及随机引物,37度1小时做RT, 以GAPDH(鼎国,400多BP)为内参做PCR,目的基因片段为584BP,反复做,目的基因及内参均未扩出,但可见引物二聚体,请问,那一步出问题?RT还是PCR?是否要换用MMLV(但MMLV扩长片段,我的基因是一短片段),随机引物与OLIGDT15或18所需RT温度是否不同?用随机引物需37度1小时,用OLIGDT15或18需42度1小时?
前辈们指点得极是。
分析原因可能如下并逐步排除:
1.提RNA中,RNA质量不好及降解,但经RNA电泳和紫外测浓度证实RNA提取过程无误。
2.RT: 为排除RT操作有误,请同室熟练操作的师姐用我的RNA样品再次行RT,但其RT产物也未见目的条带和内参。
3.PCR:引物序列和目的基因扩增条件是别人做出来的,就是说引物设计和PCR反应条件无误;
用肯定可以扩出目的基因及内参的RT产物(cDNA),作为positive control ,同时做PCR,但二者均未扩出;.......提示目的基因及内参可能有问题?
用肯定可以扩出内参的RT产物包括人,鼠样本各一,以验证是否内参存在问题,结果人cDNA可扩出内参GAPDH,鼠cDNA未见内参GAPDH;......提示内参只能扩人,而我的样本为鼠,所以出现目的基因及内参均未扩出的结果,故不能就此推论RT有误。
为进一步明确是否内参引物同时有问题,再次用GAPDH扩鼠肯定可以扩出内参的cDNA,仍无结果;.......证实GAPDH不能起到内参作用。
那么问题在哪呢???????
RT过程RNA降解?(操作中已备加小心并由熟练的师姐重复过RT)
若引物设计无问题(已证实设计引物能扩出目的基因),那引物合成是否有问题?
是否可用PCR引物为RT的特异性引物做RT?
除上述因素,还有哪些是没考虑到的?
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至少还有一条路..............跳楼,也许自挂东南枝,举身赴清池,比较体面。