【原创】评 《我做PCR一年的总结，或许对各位XDJM有用》

今天到PCR技术讨论版逛逛，看到pgming2004的精华原创贴，下载附件后读了一遍佩服楼主善于总结的同时也想补充一点个人不同的看法。

RNA 抽提（RNA Extraction）

原文：三，抽提步骤
1． 匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
2． 分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。
3． RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。
4． RNA的洗脱
小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。
5． RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

抽提步骤中
1.匀浆化，我一般将组织直接放入1ml Trizol后打碎组织，分装到EP管
2.分离，个人认为人手用力摇晃和用 机器最大速度vortex效果差不多，但是人手摇晃有点辛苦，特别是RNA含量少的组织（例如人椎间盘组织），抽提需要大量组织次数也会随之增加（常为15-20次）这是机器vortex的优势便显示出来。
3.RNA沉淀，经过许多次抽提RNA，我总结加入异丙醇后可以将盛有样品的EP管置于-20°C 冰箱过夜，这样可以大大提高RNA析出的效率。
4.RNA洗脱，倒掉EP管中上清后直接加入新配制80%酒精（是否预冷不是十分重要，但是也不要加热酒精），随即倒出酒精再重复上述操作2次。倒入酒精清洗RNA沉淀时可不进行振荡，个人认为振荡离心可能丢失少许RNA。
5.RNA再溶解，一定要控干多余酒精，这一步很重要，因为抽提产物中如果有酒精可能会影响你接下来的RT-PCR, Real-Time PCR等操作。

逆转录（reverse transcription）

原文三，RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）
1， 准备0.65ml的EP管
2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。
5， 短暂离心
6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8， -20℃保存，或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）
1， 准备0.65mlEP管
2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3， 稍离心，100℃沸水裕1min
4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶
5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6， 100℃沸水裕3min灭活

RT步骤
1.首先检测RNA样品的浓度，并稀释至10ng/ul以供RT-PCR（RT-PCR需要100ngRNA，10ulX10ng/ul）
2. 10X RT Buffer 2ul
25XdNTP mix 0.8ul
10X RT Random Primer or Oligo DT 2ul
Multiscripe Reverse Tanscriptase 1ul
RNAse Inhibitor 1ul
DEPC水 3.2ul
RNA 样品 10ul
3.循环为 25°C 10分钟， 37°C 120分钟， 85°C 5秒。

聚合酶链反应（PCR）

原文四，PCR步骤
1， 准备100ul EP管
2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）
ddH2O 37.5ul ×？
10mM dNTP 1ul ×？
10×PCR buffer 5ul ×？
25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？
上游引物 1ul ×？
下游引物 1ul ×？
模板cDNA 1ul
3， 稍离心
4， 100℃沸水浴1分钟
5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6， 再加入50ul液体石蜡封闭
7， 10000rmp离心1分钟
8， PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9，10000rmp离心5min
10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。

PCR
1.PCR反应需要 10-100ng DNA模板，50mM dNTP 0.5ul, Taq酶0.25-0.5ul足够，引物我常将其稀释成0.1ug/ul后再向50ul反应体积中加1ul即可。
2. ddH2O 39ul
10mM dNTP 2.5ul
Primers 1ul each
10X PCR Buffer 5ul
Taq Enzyme 0.5ul
DNA Template 1ul
3.PCR的条件，我一般使用
94°C 45秒
55°C 45秒
72°C 1分钟/1Kb
循环30次左右
当然万一做不出来，参考引物的Tm再调节温度。

电泳鉴定

原文3, 试剂配制和准备：
(1) 电泳缓冲液（TAE）：
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。
（2）琼脂糖溶液（1.0％）：
50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。
（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。
（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer

电泳鉴定
1.针对大分子产物可以适当降低胶的浓度0.7%，0.8%都可以，产物分子小也可提高胶的浓度至1.2%，1.4%。
2.对于EB，我首先将其稀释为1ug/ul，每100ml胶加入10ul 1ug/ul EB。
3.关于电压，一般来说根据胶的长度确定，1cm 胶 - 10V 电压。 胶长度为8cm则设定电压为80V，但是电压要求我认为不是十分严格，我常用160V跑8cm胶，结果不受不同电压大小影响。
以上是我自己的一点经验，希望大家指出不当之处，共同进步！
也希望大家将自己抽提RNA，跑PCR,RT-PCR，电泳或其他操作的经验教训也发上来，大家一起学习进步！

随贴附上一些我挑选的protocol(包括Real-Time PCR,Trizol抽提RNA，电泳AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS)