【原创】新手总结PCR/RT-PCR疑难杂症（为PCR痛苦的xdjm进来看看）
丁香园论坛
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这里，很多经常遇到的问题，比如引物设计，PCR体系和条件，电泳条带分析等，我没有一一详细列举，因为这些原因比较容易找到，我这里列举的可能多是些容易忽略的疑难杂症，希望对大家有帮助。（说了是疑难杂症了，可能有一些看法走极端了，但是为了做出实验，怀疑一切，狗急跳墙，没事找抽也是值得的）。
1.引物设计
引物的参数合理控制，像发卡结构，错配，二聚体等，只要别太过分，问题应该不大，当然没有最好，个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参数比较重要，让两条引物的退火温度尽量接近，不然后果很严重。
2.RNA提取
试剂尽量用新的，用自己的，不知道情况的不要用，如果对RNA 不放心，特别是以前提的RNA，重新反转，用RNA电泳一下看看，我直接用DNA电泳的条件电泳RNA的，应该没问题，RNA酶是存在广泛，但还没强到这么短的时间就分解吧（个人感觉的，反正我能跑出RNA条带）。
3.反转录
如果RNA表达比较少不妨多加点RNA反转；oligodT只反转真核生物mRNA，但是是从3’端开始的，如果你的目的片段在5’端，且目的基因很长，不妨试试随机引物，但随即引物反转的产物95%以上都是rRNA。
4.PCR
1.操作，快而准确，PCR出问题时不妨换个人做做试试，当你反复多次做不出结果是，很有可能这个原因，先怀疑自己，再怀疑试剂和仪器，毕竟，它们都比人（的操作）稳定；
2.PCR仪，换个实验室，用别人的PCR仪做个试试；
3.taq酶，个人感觉各个品牌的酶有差别但不是很大，关键酶用了多长时间，太长当然不好，用配套的buffer，以前剩的buffer就不要用了，该浪费就浪费吧，吃坏东西会拉肚子的；
4.模板，能做出内参不一定能做出目的条带，内参表达比较多，降解一点也不会影响，目的条带就不一定了，特别是目的片段在5’端时，因为DNA/RNA是从5’开始降解的；
5.水，用压过的去离子水，不然可能会有蛋白酶污染；
6.EP管，也要压过的，另外国产的不行换进口的试试，不是我崇洋媚外，国产货实在太不争气了，我用国产管和进口管做明显有差异；
7.程序，PCR时设的程序不光可以调退火温度，做不出来时，不妨调下延伸时间，还有开始时变性的时间都可以试试，试试而已，反正你现在做不出来；
8.温度，不要局限于G+C或引物说明书的退火温度，扩大范围，广撒网；
5.电泳，电压调低点，时间长点，胶浓度大点试试，别忘加EB（我犯过的低级错误）
确定成像仪正常工作，要是你做的很好，而最后成像出问题了，那多冤呀。
另外当实验多次无法做出结果时，不妨试试按部就班的排除各个因素，虽然这样有点慢，但总比做不出来好
1.让别人给你提RNA，做反转，然后让别人给你做次PCR，你自己用这个模板也做一次，确定是反转之前出的问题，还是反转之后的问题，如果人家能作出来而你做不出来，同样的模板，那就是后面PCR的原因了。
2.自己用同样的模板加两份样，一份给别人做PCR和电泳，一份自己做，如果人家作出来了，你没作出来，那说明你的操作和体系没有问题（怀疑自己操作的，可以在实验室找个人帮你加样），电泳和成像有问题，还很有可能是PCR仪的问题，不要说实验室其他人用它能作出来呀，说不定你的目的条带比较特殊，比较娇气呢；
如果你俩都没做出来，那就是你的操作和体系的原因了（因为1中别人给你做出来过，所以看看他的操作和体系跟你有么差别），具体看上面，细节很多，每个都可能是。
3.如果第二步别人能做出来，你不能，那让他再给你做一次（如果你觉得麻烦他太多次了，告诉他这是最后一次了），PCR完了后，一部分让他给你电泳，一部分自己拿回来电泳，看看是不是电泳的问题。电泳的条件和PCR的条件可以问问别人，任何一个小的差异都值得尝试一下。
我也是个刚接触PCR六周的新手，如果这里面有错误的地方，大家及时提醒我一下，还有其他的容易忽略的问题我没想到的，希望各位高手补充，尽量不要再让这些小问题浪费我们大量的时间了。
1.引物设计
引物的参数合理控制，像发卡结构，错配，二聚体等，只要别太过分，问题应该不大，当然没有最好，个人感觉上下游两条引物的退火温度这个参数比较重要，让两条引物的退火温度尽量接近，不然后果很严重。
2.RNA提取
试剂尽量用新的，用自己的，不知道情况的不要用，如果对RNA 不放心，特别是以前提的RNA，重新反转，用RNA电泳一下看看，我直接用DNA电泳的条件电泳RNA的，应该没问题，RNA酶是存在广泛，但还没强到这么短的时间就分解吧（个人感觉的，反正我能跑出RNA条带）。
3.反转录
如果RNA表达比较少不妨多加点RNA反转；oligodT只反转真核生物mRNA，但是是从3’端开始的，如果你的目的片段在5’端，且目的基因很长，不妨试试随机引物，但随即引物反转的产物95%以上都是rRNA。
4.PCR
1.操作，快而准确，PCR出问题时不妨换个人做做试试，当你反复多次做不出结果是，很有可能这个原因，先怀疑自己，再怀疑试剂和仪器，毕竟，它们都比人（的操作）稳定；
2.PCR仪，换个实验室，用别人的PCR仪做个试试；
3.taq酶，个人感觉各个品牌的酶有差别但不是很大，关键酶用了多长时间，太长当然不好，用配套的buffer，以前剩的buffer就不要用了，该浪费就浪费吧，吃坏东西会拉肚子的；
4.模板，能做出内参不一定能做出目的条带，内参表达比较多，降解一点也不会影响，目的条带就不一定了，特别是目的片段在5’端时，因为DNA/RNA是从5’开始降解的；
5.水，用压过的去离子水，不然可能会有蛋白酶污染；
6.EP管，也要压过的，另外国产的不行换进口的试试，不是我崇洋媚外，国产货实在太不争气了，我用国产管和进口管做明显有差异；
7.程序，PCR时设的程序不光可以调退火温度，做不出来时，不妨调下延伸时间，还有开始时变性的时间都可以试试，试试而已，反正你现在做不出来；
8.温度，不要局限于G+C或引物说明书的退火温度，扩大范围，广撒网；
5.电泳，电压调低点，时间长点，胶浓度大点试试，别忘加EB（我犯过的低级错误）
确定成像仪正常工作，要是你做的很好，而最后成像出问题了，那多冤呀。
另外当实验多次无法做出结果时，不妨试试按部就班的排除各个因素，虽然这样有点慢，但总比做不出来好
1.让别人给你提RNA，做反转，然后让别人给你做次PCR，你自己用这个模板也做一次，确定是反转之前出的问题，还是反转之后的问题，如果人家能作出来而你做不出来，同样的模板，那就是后面PCR的原因了。
2.自己用同样的模板加两份样，一份给别人做PCR和电泳，一份自己做，如果人家作出来了，你没作出来，那说明你的操作和体系没有问题（怀疑自己操作的，可以在实验室找个人帮你加样），电泳和成像有问题，还很有可能是PCR仪的问题，不要说实验室其他人用它能作出来呀，说不定你的目的条带比较特殊，比较娇气呢；
如果你俩都没做出来，那就是你的操作和体系的原因了（因为1中别人给你做出来过，所以看看他的操作和体系跟你有么差别），具体看上面，细节很多，每个都可能是。
3.如果第二步别人能做出来，你不能，那让他再给你做一次（如果你觉得麻烦他太多次了，告诉他这是最后一次了），PCR完了后，一部分让他给你电泳，一部分自己拿回来电泳，看看是不是电泳的问题。电泳的条件和PCR的条件可以问问别人，任何一个小的差异都值得尝试一下。
我也是个刚接触PCR六周的新手，如果这里面有错误的地方，大家及时提醒我一下，还有其他的容易忽略的问题我没想到的，希望各位高手补充，尽量不要再让这些小问题浪费我们大量的时间了。
