利用共聚焦显微镜实现 DNA 修复蛋白可视化

激光诱导 DNA 损伤后 U2OS 细胞的活细胞成像

双链 DNA 断裂是对 DNA 损伤最有害的形式之一。损伤之后，细胞中的 DNA 损伤反应（DDR）通路被触发，诱导 DDR 因子募集到断裂位点，并启动细胞周期检查点信号传导和 DNA 修复活性的调控。精准的信号转导和断裂位点修复对于细胞的生存和防止致癌突变至关重要。因此，了解 DNA 修复过程中的相关机制尤为关键。在此应用中，我们使用 FV3000 共聚焦显微镜，研究了 U2OS 细胞（人骨肉瘤上皮细胞）DNA 修复蛋白在激光诱导损伤处（包括双链 DNA 断裂位点）的募集过程。采集的图像不仅帮助我们确定募集到断裂位点修复蛋白的动力学信息和聚集水平，还验证了内源转录调节因子和 DDR 通路因子在 DNA 断裂位点的共定位。

 

图 1：实验方案示意图

 

将 MRE11 cDNA 克隆到带有 GFP 标签的表达载体中，然后将其转染到 U2OS 细胞。在使用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）或 Hoechst 进行标记后，使用 FV3000 共聚焦显微镜的 405 nm 激光对核内目标区域（ROI）进行线扫描诱导 DNA 损伤。随后使用 488 nm 激光进行活细胞成像，监测响应激光诱导损伤的 MRE11 募集的动力学过程。

 

成像条件

物镜：60 倍超级色差校正油浸物镜（PLAPON60XOSC）
显微镜：FLUOVIEW FV3000 激光扫描共聚焦显微镜
激光：405 nm（ROI 刺激），488 nm（GFP，绿光）

 

用于定量测量的温和活细胞成像

由于延时成像过程中激光反复照射产生的光漂白和光毒性问题，会影响实验定量测量的准确性。我们的实验需要在强光刺激与温和活细胞成像之间取得平衡，在激光诱导 DNA 损伤后立即捕获可定量的修复蛋白动力学数据。为此，我们使用了Evident FV3000 共聚焦显微镜，利用 FV3000 特有的 TruSpectral 全真光谱检测技术和高灵敏度 GaAsP 检测器，最大限度降低活细胞连续成像所需的激光强度。此外，我们在整个成像实验过程中一直使用 TruFocus 来保持对焦。这些技术帮助我们获取准确的时间序列数据，从而能够对 DNA 断裂位点上 DDR 因子 MRE11 的因损伤产生的聚集进行定量分析。

 

图 2：损伤诱导 MRE11 在 DNA 断裂位点上聚集

 

利用 405 nm 激光对表达 GFP-MRE11 的 U2OS 细胞进行激光诱导 DNA 损伤，然后用 488 nm 激光对 GFP 进行时间序列成像。以 20 秒间隔对细胞成像 6 分钟，以便对 DNA 损伤前后 MRE11 的定位进行可视化和量化。

 

超级色差校正物镜实现精确的共定位分析

除了研究 MRE11 募集至链断裂位点的动力学过程之外，我们还检查了γH2AX（γH2AX 是一种在 DNA 双链断裂处被磷酸化并激活 DDR 通路的组蛋白）和 CHD4（一种在表观遗传转录调控中起重要作用的蛋白质）的反应。对于精确的共定位研究而言，关键点在于最大限度减小不同采集通道横向的色差偏移。为了降低横向和轴向色差对共定位研究的影响，我们使用了 Evident 超级色差校准物镜 PLAPON60XOSC2 并获得了精准可靠的共定位图像。这样我们就能够确定 CHD4 和γH2AX 在细胞核 DNA 损伤位点的共定位。

 

图 3：募集内源性 DNA 损伤修复蛋白至 DNA 链断裂处

 

在对 U2OS 细胞（人骨肉瘤上皮细胞）进行激光诱导 DNA 损伤后检测内源性 CHD4（绿色，Alexa Fluor 488）和γH2AX（红色，Alexa Fluor 594）。通道合并图像显示 CDH4 和γH2AX 的共定位。