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利用显微镜相机实现荧光最佳成像效果的方法

Evident

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荧光成像需要维持一个微妙的平衡。一方面需要采集足够强的信号,这可以通过延长曝光时间或增强激发光实现。另一方面,需要通过缩短激发时间和降低激发光强度来最大限度降低样品条件下的光毒性。探索如何利用显微镜相机实现这一平衡的最佳方法。

 

使用直方图

直方图可以帮助确定理想的曝光时间。

直方图就是反映信号强度分布的图。直方图的X轴代表信号强度。数据分布范围为零到相机最大信号强度。每个 X 值对应的直方图高度代表了该信号强度下的像素数量,如下图 1 所示。

图 1:图像的直方图。(a)原始图像,(b)原始图像中每个像素的信号强度,(c)根据原始图像得到的直方图

 

直方图的形状和分布可以帮助我们判断当前的曝光时间是否合适。在大多数荧光成像情况下,多数像素为没有信号的深色背景,这会导致直方分布图在背景强度附近出现峰值。

如果直方图过于集中于低信号区域,则说明曝光时间太短(图 2,中)。如果其在最大信号处出现陡壁,则说明信号值已达到饱和(图 2,右)。这种情况下,可以降低激发光强度或缩短曝光时间。 

图 2:正常曝光(左),曝光不足(中)和在黄色标记处曝光过度(右)的直方图。

 

让显示动态范围与数据动态范围匹配

某些图像采集软件具有自动显示调整功能,这种功能能够在不改变原始图像数据的前提下获得更好的可见度,这同时也反映了信号强度和显示亮度之间的联系。

让显示动态范围与数据动态范围(从背景强度到最亮信号的范围)相匹配,就可以在不改变原始图像数据的条件下让图像获得更好的展示效果(图 3,右侧)。而使用直方图可以更方便地解释这一调整方法。

图 3:显示调节。(a)原始设置。显示信号的亮度比显示动态范围(255)暗得多。(b)调整显示条件。

 

这里我们总结了为荧光成像实验设置显微镜相机的六个常用步骤。需要注意的是,最佳操作步骤取决于具体应用和样品。

  1. 确定观察倍率。
  2. 调整标本的对焦,找到待测区域。建议进行自动显示调节。在不观看实时图像或拍照时,请始终关闭荧光光闸。
  3. 设定用于图像采集的相机参数(如,分辨率、曝光时间)。
  4. 尝试使用尽可能弱的激发光并延长曝光时间,直到信号高于背景噪声为止。
  5. 如果曝光时间过长,则逐步增强激发光。
  6. 检查直方图确认信号没有过饱和。

 

进行荧光成像时要时刻考虑样品和应用

图像采集的最佳设置最终取决于样品和应用。如果样品容易受损,则可能需要使用尽可能弱的激发。另外,在需要采集快速现象时,使用较短的曝光时间和相对较强的激发光可能效果最好。无论哪种方式,直方图和显示调整都可以帮助确定理想的采集条件。

 

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