Fluo-4 AM 荧光钙离子成像

钙离子在很多生理活动中都发挥着重要作用，细胞荧光钙离子成像技术是利用钙离子指示剂将细胞内钙离子浓度变化转化为荧光信号，从而使细胞电活动转化为可记录的光信号的成像技术。

肠神经胶质细胞的活动与钙离子密切相关，利用钙离子指示剂监测神经胶质细胞的活动就显得尤为重要。钙离子荧光指示剂在未结合钙离子前几乎无荧光，与钙离子结合后，荧光强度显著增强。

我们以 Fluo-4 AM 荧光钙离子探针为例，观察肠胶质细胞的兴奋变化。

• 无菌 PBS 溶液、5 μM Fluo-4 AM、DMEM/F12 培养基
• 共聚焦培养皿、无菌枪头
• 转盘共聚焦显微镜

（1）提前一天将原代肠胶质细胞接种在共聚焦培养皿上；

（2）第二天观察细胞状态良好后，弃去培养基，PBS 清洗三次；

（3）加入适量的含有 5 μM Fluo-4 AM（Beyotime，S1060）的DMEM/F12 培养基，37 ℃ 孵育 30 min;

（4）PBS 清洗，置于转盘共聚焦显微镜（UltraVIEW VoX，PerkinElmer）上观察（成像30～60 秒采集基础状态图像，添加相应药物并收集图像），使用 Volocity Demo 6.0（PerkinElmer Inc.）进行 Ca²⁺ 分析。

• 提前一天准备细胞，细胞量适中，不能过多，也不能过少，保证高倍视野下细胞之间稍有空隙而不过分疏松；
• 细胞清洗操作轻柔，枪头勿直接接触细胞，液体沿培养皿壁缓缓流下；
• 探针充分孵育，且全程避光；
• 置于转盘共聚焦显微镜上观察加药时，尽量在边缘给药，以防给药操作影响细胞状态;
• 探针孵育后，要充分清洗以排除残留探针的干扰；
• 若荧光强度太弱，则可适当延长孵育时间或增加探针浓度；