抗CD3 McAb诱导的细胞毒性T细胞功能的检测
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抗CD3 McAb诱导的细胞毒性T细胞功能的检测
【试剂及材料】
(1) 靶细胞:EB病毒转化的B淋巴母细胞。
(2) 含5%NCS的RPMI-1640完全培养液
(3) 100μCi/ml 51 Cr
(4) 抗CD3 McAb(4μg/ml)
(5) 2%Triton X-100。
【操作方法】
(1) 靶细胞的标记:将5×105 /L 1.9ml EB病毒转化的B细胞和100μCi51 Cr/ml 100μl加入24孔培养板孔中,置37℃,5%CO2 温箱孵育18~24h。收集放射性标记的靶细胞用完全培养液洗一次,室温1500r/min离心5min。用台盼蓝染色计数细胞活性后,用完全培养液调整细胞浓度至1×105 /ml;
(2) 效应细胞的制备:取无菌肝素抗凝血,采用密度梯度离心法分离PBMC,用完全培养液调整细胞浓度为1×106 /ml;
(3) 在96孔培养板中分别加入效应细胞100μl,同位素标记的靶细胞50μl和抗CD3 McAb 50μl。设仅含靶细胞(无效应细胞和抗CD3 McAb)的自然释放对照孔,标记靶细胞和150μl 2% Triton X-100作为最大释放对照孔,含靶细胞和效应细胞的自然杀伤细胞活性孔。每份均为3复孔;
(4) 500~800r/min离心2min,置37℃,5%CO2 温箱中温育4h;
(5) 1400r/min离心5min,用加样器从各孔收集100μl培养上清或用多孔收集器吸出全部上清,用γ计数器测量每份上清的cpm值;