微型双功能抗体抗CD3/抗Pgp的构建和表达

【摘要】目的 构建和表达抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体，并测定该微型双功能抗体的生物学活性。方法 采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3/抗CD20微型双功能抗体，并用双脱氧终止法测定DNA序列；采用亲和层析法纯化该产物，并用Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物；采用免疫荧光法、放射免疫分析法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果 DNA序列测定结果表明：抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体已构建成功，表达可溶性产物的产量达2mg/l以上，纯化产物中二聚体的比例达90%，具有与Jurkat（CD3+）和K562/A02细胞（Pgp+）结合的活性，与抗CD3ScFv及抗PgpScFv的亲合常数相当且能同时与Jurkat和K562/A02细胞结合形成玫瑰花环。结论 首次成功地构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体，并获得高效表达，表达产物具有与相应二个靶抗原结合的活性，应用针对特异肿瘤抗原的单克隆抗体对肿瘤进行治疗是肿瘤免疫疗法的重要组成部分。与传统化疗相比，单抗具有针对性强的特点，因此避免了对正常组织的杀伤，特别对于清除肿瘤的残留灶、转移灶具有良好应用前景。

单抗应用于肿瘤的治疗主要有两方面的困难：首先具有恒定区的大分子量单抗具有较长的半衰期且能介导CDC及ADCC作用但且很难穿透肿瘤发挥杀伤作用。而缺失恒定区的小型基因工程抗体虽然具有较好的穿透性，但半衰期短且本身细胞毒作用低。因此，抗体片段与放射性同位素、前药（prodrug）、生物毒素及免疫效应细胞形成偶联物成为治疗肿瘤特别是实体瘤的首选方案。

其中最有临床应用前景的是利用双特异抗体使针对肿瘤抗原的单抗与效应细胞相连，共同作用于肿瘤细胞，实现肿瘤的靶向治疗。Diabody[1]是基因工程双功能抗体的一种形式。这类抗体片段通常是由一个启动子控制下的两个顺反子表达产物间反向配对而成具有两个抗原结合位点的双特异抗体片段。

它的基本原理是同一顺反子中VH和VL因Linker太短（通常只有5-12个氨基酸），产生空间位阻，不能配对，只能与另一顺反子上的VH和VL配对，从而形成二聚体。

通常使用的效应细胞主要有T细胞（CD2，CD3）、NK细胞（CD16）、单核/巨噬细胞（CD64）、树突状细胞（CD64）和激活的髓系细胞（CD64，CD89），由于存在以下三方面的原因，使得以T细胞为效应细胞要比其它两类细胞为效应细胞来构建双特异抗体更为常见：

第一.T细胞群中存在着免疫记忆细胞；

第二.有证据表明在恶性肿瘤患者体内存在着肿瘤特异性的T细胞；第三.体内外实验表明抗CD3抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）比IL-2激活的杀伤细胞（LAK）具有更强大的细胞毒效应[2]。体内外生物学实验结果表明：Diabody能同时与T细胞和癌细胞结合，并通过激活T细胞，来靶向杀灭癌细胞[3，4]。

HIT3a[5]和PHMA02[6]是我所研制的鼠源性抗CD3和抗Pgp（P-glycoprotein）单克隆抗体，我们在克隆单克隆抗体HIT3a和PHMA02轻、重链可变区基因的基础上，构建和表达了抗CD3/抗Pgp Diabody，并研究了其生物学功能。

一、材料与方法

1、材料

（1）细胞系和载体

E.coli 16C9由本室保存。多药耐药细胞系K562/A02由本室建立[7]。Jurkat 和K562细胞系有本室保存，培养在含10%小牛血清（本所科技开发公司）的RPMI1640（GIBCOBRL）。抗CD3 ScFv表达载体[8]和抗Pgp ScFv表达载体本室构建。表达载体pYZF和克隆载体pYZL由我室保存。

（2）酶和试剂

Tag DNA聚合酶，限制性内切酶mluI，nheI，sphI，notI均购自GIBCOBRL公司，抗CD3单克隆抗体HIT3a由本所协和科技公司提供，抗Pgp单克隆抗体PHMA02由本室制备。鼠抗E-tag抗体，HRP标记的鼠抗E-tag抗体及抗E-tag亲和层析柱均购自Pharmacia公司。FITC标记的羊抗鼠IgG多抗购自北京中山生物工程公司。其它均为国产分析纯生化试剂。

（3）PCR引物

P1 5’ CTA GCG CAC GCG TAC GCT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CC 3’ （mluI）

P2 5’ CGA CCC TCC GCC ACC CCG TTT CAG CTC CAG CTT G 3’

P3 5’ GGT GGC GGA GGG TCG CAG GTC AAA CTG CAG CAG TC 3’

P4 5’ GAG CTA GCT AGC TCA TGA GGA GAC GGT GAC CGT G 3’ （nheI）

P5 5’ CGA CCC TCC GCC ACC CCG TTT ATA TTC CAG CTT GGT 3’

P6 5’ GGT GGC GGA GGG TCG CAG GTG CAG CTG CAG CAG T 3’

P7 5’ GAA TAT CGC ATG CGG TGG TCA TGA GGA GAC GGT GAC CGT G 3’ （sphI）

P8 5’ CTT CGA GCT AGC TAC CCG GGG ATC CTC TAG AG 3’ （nheI）

P9 5’ CGC ACC TGC GGC CGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG 3’ （notI）

2、方法

（1）DNA的酶切、连接、转化等常规分子生物学操作按文献[9]进行。

（2）抗CD3/抗Pgp Diabody表达载体的构建

利用PCR法从抗CD3 ScFv和抗Pgp ScFv表达载体上分别扩增CD3VL，CD3VH，PgpVL，PgpVH基因，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，利用overlap PCR，以G4S作为连接肽，分别将CD3VL与PgpVH，PgpVL与CD3VH连接形成DNA片段CD3VL-PgpVH、PgpVL-CD3VH。

经琼脂汤凝胶电泳分离纯化后， DNA片段PgpVL-CD3VH用mluI+sphI消化，并与经mluI+sphI消化的克隆载体pYZL连接，经转化，鉴定后，提取质粒，再用PCR扩增DNA片段PgpVL-CD3VH，使其5’端加上引导肽，3’端加上notI识别位点。

经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用nheI+ notI消化，先前扩增的CD3VL-PgpVH用mluI+nheI消化，将这两个酶切片段与经mluI+ notI消化的表达载体pYZF连接，形成抗CD3/抗Pgp Diabody表达载体pAYZDCP。

（3）抗CD3/抗Pgp Diabody的高效表达

将载体pAYZDCP转化E.coli16C9，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素（0.1mg/ml）的2YT培养基（1.6%胰蛋白胨，1%酵母提取物，0.5%NaCl）中，37。C振荡培养8h后。

按1：2的比例转接于含氨苄青霉素（0.1mg/ml）的Ap5培养基（0.15%葡萄糖，1.1%酸水解酪蛋白，0.06%酵母提取物，0.019%MgSO4， 0.107%NH4Cl， 0.373%KCl， 0.12%NaCl， 0.12mol/L三乙醇胺PH7.4）中，25。C振荡培养24h，4。C离心收集菌体，冻融菌体沉淀后。

加入细菌周质腔提取液（三羟甲基氨基甲烷25mmol/L，乙二胺四乙酸1mmol/L，苯甲基磺酰氟（PMSF）0.1mmol/L，蔗糖20%（W/V），NaCl 200mmol/L，PH7.5），于4。C轻摇1h，12 000r/min，4。C离心10min，收集上清为表达产物的粗提物。

（4）抗CD3/抗Pgp Diabody的纯化

应用抗E-tag亲和层析柱纯化抗CD3/抗Pgp Diabody。10mMMES（PH5.5），1mMEDTA 平衡，0.1mM甘氨酸洗脱（PH2.7），FPLC收集洗脱峰。15%SDS-PAGE及Western blot对纯化后的蛋白进行分析。

（5）大小排阻层析

取500μl样品上样于Superdex75（9/60）（Pharmcia））分子筛层析柱上，用PBS洗柱，流速为0.25ml/min，其操作过程均在FPLC（Pharmacia）上完成.

（6）抗CD3/抗Pgp Diabody与Jurket细胞及K562/A02细胞的结合活性的测定

应用活细胞间接免疫荧光法（FACS）

（7）抗CD3/抗Pgp Diabody亲和常数的测定

应用放射免疫分析法测定抗CD3/抗Pgp　Diabody与Jurket细胞（CD3抗原）及K562/A02细胞（Pgp抗原）的亲和常数。用125I标记抗CD3/抗Pgp Diabody（氯胺T法），分别与Jurket细胞或K562/A02细胞37。C共同孵育1h，2000rpm/min×10min ，4。C 离心，弃上清，PBS洗细胞，重复4次，γ记数仪测定CPM值。

（8）竞争性免疫荧光抑制实验

将一定浓度的纯化抗CD3/抗Pgp　Diabody和单抗PHMA02或单抗HIT3a混合，再与1×106K562/A02细胞或Jurket细胞4。C共同孵育1h， 2000rpm/min×10min 4。C离心，弃上清，PBS洗细胞，重复３次。将细胞重悬于20μl FITC标记的羊抗鼠IgG 多抗，4。C共同孵育1h，2000rpm/min×10min 4。C离心，弃上清，PBS洗细胞，重复３次，FACS测定荧光强度。

（9）玫瑰花环实验

将一定浓度的纯化后的Diabody与1×106K562/A02细胞4。C共同孵育1h，2000rpm/min，4。C离心10min，弃上清，PBS洗细胞，重复3次，再加入从PBMC中分离的T细胞（1×107），4。C共同孵育2h，光学显微镜下观察玫瑰花环的形成。

二、结果

1、抗CD3/抗Pgp Diabody 表达载体的构建

为防止链内配对，CD3VL基因羧基端与PgpVH基因的氨基端通过短肽G4S相连。PgpVL基因的羧基端与CD3VH基因的氨基端也通过相同的短肽连接，并经与克隆载体连接及随后的PCR，抗PgpVL基因的氨基端加上与表达载体相同的SD序列和引导肽序列。

最后将上述两片段与带有纯化标记E-tag短肽表达载体连接而构建成Diabody表达载体pAYZDCP，经序列测定其核苷酸序列与原始序列相同。该表达载体在低磷酸盐的培养条件下，由启动子phoA诱导合成带双顺反子的mRNA，并在该mRNA的2个含有SD序列的位置合成相应的多肽链，在引导肽stII的作用下分泌到细菌周质腔，形成Diabody。

2、抗CD3/抗Pgp Diabody 的表达和纯化

用抗CD3/抗Pgp Diabody表达载体pAYZDCP转化E.coli 16C9，经低磷酸盐诱导表达，在信号肽的引导下，Diabody分泌进入细菌外周质腔。应用高渗溶液提取细菌外周质腔表达产物，并用抗E-tag亲层析柱纯化。纯化产物的产量约为2mg/L。

纯化的Diabody经15%的SDS-PAGE分析，在分子量28KD和26KD各有一条蛋白带，经扫描分析28 KD的蛋白占纯化产物的62.97%，26KD的蛋白占纯化产物的33.13%。Western blot结果表明，抗E-tag抗体只能与带有E-tag片段的分子量为28KD的蛋白带杂交，而与分子量为26 KD的蛋白带无特异性反应。

3、大小排阻层析

抗CD3/抗Pgp Diabody，抗PgpScFv的滞留时间分别为77.29min，90.10 min。抗CD3/抗Pgp Diabody主峰含量≥90%，而分子量为66 KD，45KD，25KD的蛋白质标准品（Sigma）的滞留时间分别为75.16 min，79.39 min，90.18min。上述实验结果表明抗CD3/抗Pgp Diabody主要以二聚体的形式存在。

4、抗CD3/抗Pgp Diabody与Jurket细胞及K562/A02细胞的结合活性

间接免疫荧光测定结果表明，抗CD3/抗Pgp Diabody能与Jurket细胞及K562/A02细胞特异性结合，表明抗CD3/抗Pgp Diabody具有与CD3及Pgp靶抗原特意结合的能力。

5、抗CD3/抗Pgp Diabody亲合常数的测定

以放射免疫分析法测定抗CD3/抗Pgp Diabody与CD3及Pgp靶抗原的亲合力，并应用Scatchard 作图法计算亲和力常数. 抗CD3/抗Pgp Diabody的亲合常数与抗CD3ScFv及抗PgpScFv的亲合常数相当。

6、竞争性免疫荧光抑制实验

单抗HIT3a单独与Jurket细胞共同孵育，再与FITC标记的羊抗鼠IgG 多抗共同孵育，结合的阳性率为95.50%，而单抗HIT3a与抗CD3/抗Pgp Diabody混合后与与Jurket细胞共同孵育，再与FITC标记的羊抗鼠IgG 多抗共同孵育。

结合的阳性率仅为25.20%.单抗PHMA02单独与K562/A02细胞共同孵育，再与FITC标记的羊抗鼠IgG 多抗共同孵育，结合的阳性率为94.56%，而单抗PHMA02与抗CD3/抗Pgp Diabody混合后与K562/A02细胞共同孵育。

再与FITC标记的羊抗鼠IgG 多抗共同孵育，结合的阳性率仅为30.68%。实验结果表明抗CD3/抗Pgp Diabody能与全抗竞争靶抗原的结合位点，但由于Diabody为单价，而全抗为双价，所以尽管使用较高浓度的Diabody也不能完全抑制全抗与靶抗原的结合.

7、抗CD3/抗Pgp Diabody介导的K562/A02细胞与人外周血T细胞间玫瑰花环的形成

在抗CD3/抗Pgp Diabody存在的情况下K562/A02细胞与人外周血T细胞间可形成玫瑰花环，而在只有PBS存在的情况下，二者之间不能形成玫瑰花环。在抗CD3/抗Pgp Diabody存在的情况下低Pgp表达的K562敏感细胞与人外周血T细胞间不能形成玫瑰花环.表明抗CD3/抗Pgp Diabody具有同时与K562/A02细胞和人外周血T细胞特异性结合的活性.

三、讨论

肿瘤细胞对抗癌药物的耐受是导致临床化疗失败的主要原因。肿瘤细胞对一系列结构及作用机制不同的药物产生交叉耐药的现象称为多药耐药（multidrug resistance，MDR）。

产生MDR最主要的分子基础是细胞膜表面分子量为170KD的糖蛋白Pgp。Pgp是ATP依赖性的药物外排泵，可将各种不同的细胞毒药物泵出到细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，阻止药物杀伤细胞的作用。

通过对Pgp蛋白的深入研究发现，Pgp不仅与耐药相关，还与肿瘤的侵袭、转移等生物学特性相关[10] 。国内外相关资料表明，消化系统肿瘤、乳腺癌等恶性肿瘤细胞的Pgp及其mdr-1基因mRNA的水平与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。

国外发现肺癌、结肠癌转移淋巴节有Pgp阳性高表达，我们初步实验也证实，乳腺癌转移灶亦有Pgp高表达。在白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤、Pgp的高表达与疗效差是高度相关的。由此可见Pgp既可作为肿瘤恶性进展的诊断学标志，也可作为新型的治疗靶点。

而且在多种耐药的实体瘤及白血病细胞系均有Pgp的高表达，所以针对Pgp这一广谱肿瘤抗原的治疗具有广泛的应用前景。在所有正常人类组织中均可检测到P-gp及mdr-1基因的mRNA，不同器官中的Pgp及mdr-1基因mRNA的水平相差很大，在肾脏、肝、消化道、肺等器官Pgp及mdr-1基因mRNA的水平较高，而在睾丸、卵巢、子宫、皮肤等器官处于较低水平[11] 。这些研究提示Pgp与正常细胞的分泌功能密切相关。

而且，越来越多的研究表明Pgp是人体保护正常细胞免受毒物损害的机制之一。例如，在血脑屏障和胎盘组织均有Pgp的高表达。目前，抗体应用于人体发挥靶向治疗作用主要通携带细胞毒药物或标记同位素来实现，这就势必造成对Pgp高表达的正常细胞的杀伤。

而双功能抗体通过激活人体内的效应细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用，为抗Pgp抗体应用于耐药肿瘤的治疗提供了新的策略。

HIT3a是我所研制的鼠源性抗CD3的单克隆抗体，并已经过国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名。PHMA02为我室自行研制的抗Pgp的鼠源性单克隆抗体，只有针对Pgp抗原的识别功能，并无Pgp功能的抑制作用，因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能。

我室已成功构建了抗CD3/抗CD20双特异双链抗体，并进行了体外、体内活性的测定，实验证实抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有明显的抑制肿瘤生长的活性，有望成为一种新的治疗B细胞恶性肿瘤的方法[12]。与CD20相比，Pgp作为一种广谱的耐药肿瘤抗原具有更为重要的临床价值。

我们在克隆单克隆抗体HIT3a和PHMA02轻、重链可变区基因的基础上构建、表达了抗CD3/抗Pgp Diabody。纯化的抗CD3/抗Pgp diabody具有与Jurkat 和K562/A02细胞结合的能力，且在抗CD3/抗Pgp Diabody存在的情况下，Jurkat和K562/A02细胞之间可形成玫瑰花环。

说明抗CD3/抗Pgp Diabody具有亲代抗体的免疫学活性，具备将肿瘤细胞和免疫效应细胞连接在一起、使免疫细胞在肿瘤细胞周围富集，从而更有效的杀伤肿瘤细胞的作用。

已进行的细胞毒实验也表明，抗CD3/抗Pgp Diabody具有介导激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用，且杀伤作用的强弱呈剂量依赖关系（另文发表）。以上实验结果表明抗CD3/抗Pgp Diabody具有抑制肿瘤细胞生长的活性，有可能为耐药肿瘤的治疗提供新的途径。

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