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单链抗体的构建

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单链抗体的构建
 
    【材料和试剂】
    (1)杂交瘤细胞株。
    (2)大肠杆菌菌株JM109,此菌含有LacIq、LacZ、M15,可进行α-互补试验检测重组子。
    (3)克隆质粒pUC19及表达载体质粒pFUW80(有关pFUW80的性质、特点及物理图谱,详见本章其他部分)。
    (4)引物。
    (5)主要试剂:包括杂交瘤培养、RNA提取、PCR扩增所用试剂及cDNA合成试剂盒。
    【操作步骤】
    1.寡聚核苷酸引物的设计和合成  根据Ig可变区基因的序列特点,以及已发表的小鼠VH和VL基因序列,设计若干套分别对应于不同亚类Ig骨架区序列FR1和FR4的通用引物。为了便于克隆和表达,在引物两端引进合适的酶切位点。其中VH5’端引物为XhoI识别序列,VH3’端引物为SpeⅠ识别序列;VL 5’端引物为XbaⅠ,3’端引物为EcoRⅠ。利用不同的5’端和3’端引物组合进行相同的PCR扩增抗小细胞肺癌单抗的VH和VL基因,发现如下一套引物扩增效果最好;扩增产物琼脂糖凝胶电泳带均一,且无杂带。其序列如下:
     VH5’端引物(XhoⅠ): 5’-GGCTCGAG GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGCC-3’
     VH3’端引物(SpeⅠ): 5’-GGACTAGT TGCAGAGACAGTGACCGGAGTCC-3’
     VL5’端引物(XbaⅠ): 5’-CCTCTAGA GACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3’
     VL3’端引物(EcoRⅠ):5’-CCGAATTC TTTTATTTCCAGCTTGGTGCCTC-3’
    2.PCR反应扩增VH和VL 从鼠杂交瘤细胞株WLA-2C4中提取基因组DNA作为PCR反应的模板,加入引物和其他试剂。进行PCR反应。反应液总体积为100μ1,加样如下:
  5’端引物                          0.5μl(约0.2μg)
  3’端引物                          0.5μl(约0.2μg)
  2mmol/L dNTP                      10μl
  10×PCR 缓冲液                    10μl
  基因组DNA                         5μl(约0.2μg)
  ddH2 O                             74μl
  液体石蜡                          75μl
100℃变性10min后,加入Taq DNA聚合酶0.5μl(5u/μl),进行PCR循环。VH:94℃ 60s,65℃ 60s,72℃ 60s;VL:94℃ 60s,60℃ 60s,72℃ 90s。各进行30个循环。
    3、目的基因克隆  VH和VL扩增产物,经琼脂糖凝胶电泳回收后,以引物两侧的酶进行双酶切:即VH用XhoI和SpeI双酶切;VL用XbaI和EcoRI双酶切,产生具有粘性末端的酶切扩增产物。分别与经同样双酶切的pUC19质粒连接,转化JM109菌。由于pUC19质粒含有Amp和LacZ基因片段,转化入JM109菌中会产生α-互补作用;在含IPTG和X-Gal的LB平板上生长时会产生蓝色菌落;插入了目的基因(VH或VL)的重组子会导致pUC19 LacZ基因片段的失活,从而形成白色菌落。对白色菌落重组子进行双酶切鉴定。VH重组子经XhoI、SpeI双酶切,VL重组子经XbaI、EcoRI双酶切,观察是否有所需大小的带,即VH和VL扩增产物被切下。
    4.目的基因测序  取上述经蓝、白菌落筛选,双酶切鉴定正确的重组子,以双脱氧链终止法测序。
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