抗人肺腺癌单链抗体的构建
互联网
1476
抗人肺腺癌单链抗体的构建
(1)将表达载体pFUW80质粒经XbaI和EcoRI双酶切,同样双酶切在pUC19中克隆的VL基因,分别回收后,连接并转化大肠杆菌JM109株,鉴定阳性重组子(可通过XbaI、EcoRI双酶切切下合适大小的带,即VL片段)。
(2)将上述经过鉴定的重组质粒用XhoI、SpeI双酶切,回收后,与同样双酶切的在pUC19中克隆的VH基因相连,再次转化JM109感受态细菌。重组质粒筛选、鉴定同上所述。至此抗人肺腺癌单链抗体构建完成。随后分别转化不同的表达菌株进行附着型或外分泌型表达研究。
在构建单链抗体时,亦可设计一组通用引物,可用于扩增小鼠大多单克隆抗体的V区基因。在VH3’(或VL3’)端和VL5’(VH5’)端的引物中合成含有连接序列(linker),采用RT-PCR的方法先分别扩增VH和VL基因,再进行重叠延伸PCR扩增含VH-linker-VL或VL-linker-VH基因,然后克隆到原核表达载体中进行表达。
常用的PCR引物序列如下(供参考):
1) VH5’端引物
5’-GTGCAGTCGAC CA(AG)CT(GT)GTG(CG)AGTC(AT)GG-3’
2) VH3’端引物
5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTG(AC)(AG)-GAGAC(AG)TGTGAGCGTGG-3‘
3) VL5’端引物
5’-GGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATTGTGATGACCCAGTCTCCA-3’
4)VL3’端引物
5’-GCAGTCTAGA ATTATTTTAT(CT)TCCAGCTTGGTCCC-3’
【注意事项】
1.构建ScFv时可分别扩增VH和VL,并分别将其克隆至表达载体的Linker两端。如采用重叠延伸PCR方法扩增VH和VL基因,可直接将其克隆到原核表达载体中。
2.现多采用RT-PCR的方法克隆VH和VL基因。
3.引物设计:根据免疫球蛋白家族最好设计一组引物,以便能扩增出大多数单抗的VH和VL基因。
4.如为了进一步构建融合蛋白,在设计引物时均不应加终止密码。