T细胞杀伤功能的检测

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

基本方案 1 抗 CD3 诱导的 T 细胞杀伤实验

材料

$靶细胞： E B 病毒（E B V ) 转化的 B 淋巴母细胞（A T C C : # 1 6 1 2 ; 单元 8. 16) n/ R P M I -5完全培养基 lmCi/ml Na2 [51Cr] O 4 (51 Cr^ 3 0 0 mCi/mg； Amersham) ' T 细胞（效应性细胞）：单个核细胞、 T 细胞或 T 细胞亚群（单元 8 . 3 或单元 7. 2)，来自正常非免疫个体抗 CD3 抗体（IgG2a) ，由 OKT3 腹水或培养上清纯化（单元 1 . 5 ) 或商品化试剂 (Ortho Diagnostic 或 Becton Dickinson) 2 % (V /V ) Triton X-100 2 4 孔平底细胞培养板（Costar) Sorvall离心机及 HlOOOB转子（或替代品） 9 6 孔圆底细胞培养板（Costar) 1 . 在 2 4 孔板各孔中加入 5 X IO5E B V 转化的 B 细胞，补充 RPMI- 5 完全培养基至 I .9ml。再加入 0•Iml 51Cr (IOOjuCi) ， 37°C标记 18〜24h。 2 . 收集标记后的B 细胞并加入离心管中。加入 IOml R P M I -5完全培养基，室温， 250g 离心 5min，洗涤细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞（附录 3 0 。用 R P M I -5完全培养基，调整浓度至5X 103个细胞/50/^1 (即 I X l O 5个细胞/ml)。 3•从IX lO 5个细胞/IOOmI 开始，用 R P M I -5完全培养基，将效应性 T 细胞进行至少 4 个浓度的系列稀释，起始效应细胞：靶细胞（effector : target， E : T ) 为 20 : 1。 4•从4Mg/m l 开始，用 R P M I -5完全培养基，将抗 C D 3 抗体进行至少5 个浓度的4 倍系列稀释。 5 . 在 9 6 孔板各孔中，加入 50^1放射标记的靶细胞、 50^1不同稀释度的抗C D 3 抗体和 I O O W 不同稀释度的效应细胞，各组设 3 复孔。自发释放对照组只加入靶细胞（不加抗体及效应细胞）。使用单个核细胞进行实验时，应设置含靶细胞和效应细胞的对照组（不加抗体），即 N K 细胞杀伤活性对照组。在另一块 9 6 孔板中，设置最大释放对照组，其中加入 5 \ 1 0 3标记后靶细胞和 150/^12%1^1〇111-100，也设 3 复孔$

250g 离心 2m i n 后，将培养板置培养箱孵育4h 。 6•将培养板200g 离心 5min。用移液器从各孔中吸取100M1上清，或用自动收集仪收集细胞培养上清。然后用 7 液闪仪检测上清的cpm值。结果计算如下： .100X (实验组一自发释放）特异杀伤率最大释放一自发释放其中，自发释放为自发释放对照组的cpm值；实验组为待测孔c p m 值；最大释放为含 Triton孔的 cpm值。确保自发释放cpm值< 2 5 % 最大释放值。使用单个核细胞实验时，实验组 cpm值应减去无抗体组的cpm值以消除N K 细胞的影响。基本方案 2 抗原诱导的特异性T 细胞杀伤功能的检测附加材料（其他材料见基本方案 1) 合成的病毒抗原肽（推荐使用） M E M 非必需氨基酸（JRHBioscience) 含流感病毒的鸡胚尿囊液（H A 滴度 1 : 128或以上），无支原体污染（如 A /H K /; A T C C # V R 544 或 A /J A P /305; A T C C # V R 100) 含 5 % (V7 V ) FBS 的 PBS (附录 1) 流感病毒免疫后志愿者特异性T 细胞，间隔采血（单元 8. 2 和 8. 3) 6m l细胞培养管（Falcon) 1• 将靶细胞（E B V 转化的 B 细胞）用51C r 标记（见基本方案 1 ，步骤 1)。或者，用合成的病毒抗原肽冲击E B V 转化的 B 细胞。方法如下：在转化的 B 细胞中加入 1〜 10/xg合成肽，然后加入51C r , 标记 18〜24h 后直接进入步骤4 。 2•将标记后的靶细胞加入6m l 细胞培养管中（I X l O 6〜 3 X 106个细胞/管）。室温， 2 5 0 心离心 5min，弃上清。加入 0.5m l 含 I X M E M 非必需氨基酸的 R P M I -5完全培养基重悬细胞，再加入 0.1m l 病毒感染尿囊液。同时设置未感染尿囊液的阴性对照组。培养管置37°C 水浴 30min。 3•加入10m l 5 % F B S 。室温， 250g 离心 5min，弃上清。用 5m l R P M I -5重悬细胞。培养管置 37°C 水浴 5h 。 4•加入5m l 5 % F B S 。室温， 250g 离心 5min，弃上清。用 l m l R P M I -5重悬细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞（附录 3 0 , 用 R P M I -5完全培养基调整细胞浓度至5 X IO3 个细胞/0. lml。 5•将效应性T 细胞稀释后（见基本方案1 ，步骤 3)，进行杀伤功能检测。实验组和各对照组设置、上清收集及检测同前（见基本方案1 ，步骤 5 和 6)。

常见问题

本实验来自「精编免疫学实验指南」作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等

来源：丁香实验

T细胞杀伤功能的检测

基 本 方案 1 抗 CD3 诱 导 的 T 细胞杀伤实验

材 料

基本方案 1 抗 CD3 诱导的 T 细胞杀伤实验

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