为滤泡辅助性T细胞流式细胞分析染色
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一、材料和试剂
1. 抗体
(1)Ratanti-mouseCXCR5-biotin(BP Pharmingen 551960)
(2)Goatanti-ratIgG-biotin(BP Pharmingen 554014)
(3)Straptavidin-PECy7(B PPharmingen 557598)
(4)Ratanti-mouseB220-pacificblue450(eBioscience 48-0452-82)
(5)Ratanti-mouseCD11b-pacificblue450(eBioscience 48-0112-82)
(6)Ratanti-mouseCD4-APCeFluor780(eBioscience 47-0042-82)
(7)Hamsteranti-mousePD-1-PE(eBioscience 12-9985-82)
(8)MouseFcblock(BD Pharmingen 553141)
2. 其它材料:
(1)FACSbuffer:3%胎牛血清in PBS
(2)Dulbecco’sModificationEagleMedium(DMEM,Invitrogen)
(3)氯化铵(0.17M,pH7.4,过滤灭菌)
(4)锥形管(BD Labware)
(5)吲哚核酸染色(Invitrogen)
二、仪器
1. BDLSRII流式细胞仪
三、操作步骤
1. 收获脾脏,通过用显微玻片的磨砂面在5 mL 的DMEM中温和的破碎脾脏,以得到单细胞悬液。
2. 将细胞转移到50 ml 锥形管,4℃300RCF降速离心5 min。
3. 弃上清,保留沉淀。
4. 用0.17 M 氯化铵重悬细胞,冰置5 min。
5. 再加入15 mL DMEM,300RCF4℃离心5 min。
6. 弃去上清液,加入20 mL 培养液DMEM重悬细胞,细胞计数。
7. 在50 ul 的Fcblock(1:200 in FAC Sbuffer)重悬200万脾细胞,冰上孵育30 min。
8. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。
9. 弃上清,用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30 min。
10. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。
11. 弃上清,用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30 min。
12. 用200mLPBS清洗细胞,300RCF4℃离心5min。
13. 弃上清,用30ul抗体3-7混合物(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30min。
14. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。
15. 用400 uL DAPI(3 uM in PBS)重悬细胞,用BD LSR II流式细胞仪分析所得细胞。