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为滤泡辅助性T细胞流式细胞分析染色

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4403
一、材料和试剂

1. 抗体

(1)Ratanti-mouseCXCR5-biotin(BP Pharmingen 551960)

(2)Goatanti-ratIgG-biotin(BP Pharmingen 554014)

(3)Straptavidin-PECy7(B PPharmingen 557598)

(4)Ratanti-mouseB220-pacificblue450(eBioscience 48-0452-82)

(5)Ratanti-mouseCD11b-pacificblue450(eBioscience 48-0112-82)

(6)Ratanti-mouseCD4-APCeFluor780(eBioscience 47-0042-82)

(7)Hamsteranti-mousePD-1-PE(eBioscience 12-9985-82)

(8)MouseFcblock(BD Pharmingen 553141)

2. 其它材料:

(1)FACSbuffer:3%胎牛血清in PBS

(2)Dulbecco’sModificationEagleMedium(DMEM,Invitrogen)

(3)氯化铵(0.17M,pH7.4,过滤灭菌)

(4)锥形管(BD Labware)

(5)吲哚核酸染色(Invitrogen)

二、仪器

1. BDLSRII流式细胞仪

三、操作步骤

1. 收获脾脏,通过用显微玻片的磨砂面在5 mL 的DMEM中温和的破碎脾脏,以得到单细胞悬液。

2. 将细胞转移到50 ml 锥形管,4℃300RCF降速离心5 min。

3. 弃上清,保留沉淀。

4. 用0.17 M 氯化铵重悬细胞,冰置5 min。

5. 再加入15 mL DMEM,300RCF4℃离心5 min。

6. 弃去上清液,加入20 mL 培养液DMEM重悬细胞,细胞计数。

7. 在50 ul 的Fcblock(1:200 in FAC Sbuffer)重悬200万脾细胞,冰上孵育30 min。

8. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。

9. 弃上清,用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30 min。

10. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。

11. 弃上清,用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30 min。

12. 用200mLPBS清洗细胞,300RCF4℃离心5min。

13. 弃上清,用30ul抗体3-7混合物(1:50 in FAC Sbuffer)重悬细胞,冰上孵育30min。

14. 用200 mL PBS清洗细胞,300RCF4℃离心5 min。

15. 用400 uL DAPI(3 uM in PBS)重悬细胞,用BD LSR II流式细胞仪分析所得细胞。

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