为滤泡辅助性T细胞流式细胞分析染色
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一、材料和试剂
1. 抗体
（1）Ratanti-mouseCXCR5-biotin（BP Pharmingen 551960）
（2）Goatanti-ratIgG-biotin（BP Pharmingen 554014）
（3）Straptavidin-PECy7（B PPharmingen 557598）
（4）Ratanti-mouseB220-pacificblue450（eBioscience 48-0452-82）
（5）Ratanti-mouseCD11b-pacificblue450（eBioscience 48-0112-82）
（6）Ratanti-mouseCD4-APCeFluor780（eBioscience 47-0042-82）
（7）Hamsteranti-mousePD-1-PE（eBioscience 12-9985-82）
（8）MouseFcblock（BD Pharmingen 553141）
2. 其它材料：
（1）FACSbuffer：3%胎牛血清in PBS
（2）Dulbecco’sModificationEagleMedium（DMEM，Invitrogen）
（3）氯化铵（0.17M，pH7.4，过滤灭菌）
（4）锥形管（BD Labware）
（5）吲哚核酸染色（Invitrogen）
二、仪器
1. BDLSRII流式细胞仪
三、操作步骤
1. 收获脾脏，通过用显微玻片的磨砂面在5 mL 的DMEM中温和的破碎脾脏，以得到单细胞悬液。
2. 将细胞转移到50 ml 锥形管，4℃300RCF降速离心5 min。
3. 弃上清，保留沉淀。
4. 用0.17 M 氯化铵重悬细胞，冰置5 min。
5. 再加入15 mL DMEM，300RCF4℃离心5 min。
6. 弃去上清液，加入20 mL 培养液DMEM重悬细胞，细胞计数。
7. 在50 ul 的Fcblock（1：200 in FAC Sbuffer）重悬200万脾细胞，冰上孵育30 min。
8. 用200 mL PBS清洗细胞，300RCF4℃离心5 min。
9. 弃上清，用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素（1：50 in FAC Sbuffer）重悬细胞，冰上孵育30 min。
10. 用200 mL PBS清洗细胞，300RCF4℃离心5 min。
11. 弃上清，用30 ul 抗鼠CXCR5-生物素（1：50 in FAC Sbuffer）重悬细胞，冰上孵育30 min。
12. 用200mLPBS清洗细胞，300RCF4℃离心5min。
13. 弃上清，用30ul抗体3-7混合物（1：50 in FAC Sbuffer）重悬细胞，冰上孵育30min。
14. 用200 mL PBS清洗细胞，300RCF4℃离心5 min。
15. 用400 uL DAPI（3 uM in PBS）重悬细胞，用BD LSR II流式细胞仪分析所得细胞。
