临床流式细胞分析的发展趋势

二、从相对定量到绝对定量分析

细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析，以前多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表达其含量。由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异，每个实验室所用仪器的类型也不尽相同，以MFI或RFI表示某些细胞的抗原或受体的表达量缺乏可比性，虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度，但却无法准确应用这些信息。近年来，为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分，定量流式细胞术（Quantitative flow cytometry，QFCM）逐渐得到发展，其定量分析原理主要有两种：

①定量抗体微球法：在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球，此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体（McAb）反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度，根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数（抗原结合位点数）。

②定量荧光素分子微球法：在特制的微球上直接包被荧光素分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球。在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度，根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程，可求得每个细胞上的平均荧光素分子数，根据所用于样本测定的单克隆抗体（McAb）与荧光素结合的分子比例，计算每个细胞上的平均抗原分子数。单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展，为研究细胞的生物学、生物化学及免疫学等性质提供了更精确的方法。例如，白血病性原始细胞的膜CD45分子表达量低于正常淋巴细胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板，活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高，活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞，强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。CD8+T淋巴细胞膜CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标；AIDS治疗有效后，CD8+T淋巴细胞CD38分子数降低。

三、从单色到多色荧光分析

流式细胞分析从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色，一般只能分析单细胞的一种或两种信息。随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。目前，淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析均应使用至少三色荧光以上分析才更可靠。例如：辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5+CD10—CD19+CD45+。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势，有条件时应尽可能地采用。

四、从细胞膜成份到细胞内成份分析

流式细胞膜免疫表型分析是最重要的分析内容之一，很多细胞亚群的检测均是以膜免疫表型为主，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而，仅有膜免疫表型的分析是不够的，尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常较为困难，而细胞浆或细胞核内成份则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如，急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶（MPO）是最为准确的系列标志，急性B淋巴细胞白血病性原始细胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志；检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达，是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段，而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞（Th）进一步分成Th1和Th2亚类，在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素（IFN^- γ）、白细胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法结合，可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子（Cytokine），如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后，辅助/诱导T淋巴细胞亚类—Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3+CD4+CD8—IFN^- γ+IL-1+。