当前临床流式细胞分析的发展趋势

流式细胞分析（Flow cytometry，FCM）是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它具有如下几个特点：

①标本只要是单细胞即可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析，因此，实际上所有组织细胞均可用于分析。

②极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

③可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。

④定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca++浓度、酶活性、细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。

由上述几个主要特点可知，FCM是一种在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景的细胞分析技术，尤其是随着人类基因组计划完成后，流式细胞分析在单细胞水平研究基因的表达、调控及功能等也将有着更广泛的应用。

近年来，随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的迅速发展，流式细胞仪迅速进入临床实验室，临床流式细胞分析（Clinical flow cytometry）在临床检验医学中的应用范围不断拓宽，一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可缺少的内容。

当前，临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点，其发展趋势主要体现在以下几个方面。

一．从相对细胞计数到绝对细胞计数

流式细胞分析最大的优点是对混合细胞群体中亚群细胞的计数，如淋巴细胞可依其表面标志的不同分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）、NK细胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴细胞又可进一步分为辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD4-CD8+）等。

这些亚群细胞计数过去多以相对百分比表达结果，由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群体中所占的比例，并不能体现在单位体积血液中的绝对数量，而现在临床一些疾病的诊断需要考虑细胞的绝对数量，如艾滋病患者的血液中辅助/诱导T细胞（CD3+CD4+CD8-）＜200个/μl，而仅有HIV感染而未发病者的＞200个/μl。

T淋巴细胞亚群的绝对计数在国外实验室早已成为常规检查，而国内仅有少数实验室开展。

流式细胞绝对计数在临床可开展的项目包括：

①淋巴细胞亚群，尤其是T淋巴细胞亚群的绝对计数。

②外周血或骨髓中造血干/祖细胞的绝对计数。

③血液中网织红细胞的绝对计数。

④血液中血小板数量，尤其是血小板减少症患者血小板的绝对计数，此种计数优于血细胞分析仪法，已成为血小板计数的国际推荐参考方法。此外，可能出现在血液中的其它一些稀少细胞（如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等）的计数，也将发展为流式细胞绝对计数。流式细胞绝对计数的开展对临床疾病的诊断、治疗等有重要意义。

二．从相对定量到绝对定量分析

细胞的多种成分如某些抗原或受体表达的流式细胞分析，以前多以平均荧光强度（MFI）或相对荧光强度（RFI）表达其含量。

由于流式细胞仪每次的仪器状况可出现差异，每个实验室所用仪器的类型也不尽相同，以MFI或RFI表示某些细胞的抗原或受体的表达量缺乏可比性，虽然流式细胞仪有极高的荧光灵敏度，但却无法准确应用这些信息。

近年来，为了通过FCM精确定量分析细胞的某些成分，定量流式细胞术（Quantitative flow cytometry，QFCM）逐渐得到发展，其定量分析原理主要有两种：

①定量抗体微球法：在特制的微球上包被已知分子数的羊抗鼠IgG分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子数的混合微球，此微球与待测标本在相同条件下与荧光素标记的单克隆抗体（McAb）反应后在流式细胞仪上测定其荧光强度。

根据微球上所包被的羊抗鼠IgG分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本中阳性细胞的对数荧光强度代入方程即可求得其每个细胞上的平均抗原分子数（抗原结合位点数）。

②定量荧光素分子微球法：在特制的微球上直接包被荧光素分子，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球。

在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球及待测细胞的荧光强度，根据微球上所包被的荧光素分子数和与之对应的对数荧光强度计算回归方程，再将待测样本阳性细胞的对数荧光强度代入方程，可求得每个细胞上的平均荧光素分子数，根据所用于样本测定的单克隆抗体（McAb）与荧光素结合的分子比例，计算每个细胞上的平均抗原分子数。

单细胞的抗原或受体定量是流式细胞分析的重要进展，为研究细胞的生物学、生物化学及免疫学等性质提供了更精确的方法。

例如，白血病性原始细胞的膜CD45分子表达量低于正常淋巴细胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子数显著高于静止血小板，活化淋巴细胞的CD69分子数显著增高，活化中性粒细胞膜CD64分子数显著高于静止中性粒细胞，强直性脊柱炎患者T淋巴细胞膜HLA-B27分子数明显增高。

CD8+T淋巴细胞膜CD38分子数增高是慢性HIV感染者病情发展或死亡的更有力的预后指标；AIDS治疗有效后，CD8+T淋巴细胞CD38分子数降低。

三．从单色到多色荧光分析

流式细胞分析从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色，一般只能分析单细胞的一种或两种信息。随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。目前，淋巴细胞亚群的分析、白血病免疫表型分析均应使用至少三色荧光以上分析才更可靠。例如：辅助/诱导T淋巴细胞四色荧光分析的免疫表型为CD3⁺CD4⁺CD8^-CD45⁺，慢性淋巴细胞白血病的异常淋巴细胞的四色免疫表型为CD5⁺CD10^-CD19⁺CD45⁺。多色荧光分析是流式细胞技术发展的必然趋势，有条件时应尽可能地采用。

四．从细胞膜成份到细胞内成份分析

流式细胞膜免疫表型分析是最重要的分析内容之一，很多细胞亚群的检测均是以膜免疫表型为主，如T、B淋巴细胞和NK细胞分析、白血病免疫分型等。然而，仅有膜免疫表型的分析是不够的，尤其对一些细胞的系列鉴定和功能状态分析常较为困难，而细胞浆或细胞核内成份则更能反映某些细胞的系列特征和功能变化。随着近年来细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一个热点。例如，急性髓系白血病性原始细胞浆中检测到髓过氧化物酶（MPO）是最为准确的系列标志，急性B淋巴细胞白血病性原始细胞浆中检测到CD79a是最为特异的系列标志；检测T淋巴细胞胞浆内细胞因子合成的种类及含量和膜CD69分子表达，是判断T淋巴细胞活化及其功能的重要手段，而且还能将辅助/诱导T淋巴细胞（Th）进一步分成Th1和Th2亚类，在Th1和Th2细胞浆中可分别合成γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通过细胞内成分检测技术与多色免疫荧光分析方法结合，可检测不同细胞亚群合成的不同细胞因子（Cytokine），如用五色疫荧光分析血液中淋巴细胞经诱导剂刺激后，辅助/诱导T淋巴细胞亚类——Th1细胞内有细胞因子合成的免疫表型为CD3⁺CD4⁺CD8-IFN-γ+IL-1⁺。

五．液体中可溶性成分的流式细胞分析

从传统意义上讲，流式细胞技术只能分析细胞及其成分，液体中的可溶性成分则不能进行分析。然而，如果将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒（如乳胶颗粒）上，流式细胞仪便可以对其进行分析，这就是近年来发展起来的流式微球分析（Cytometric bead assay，CBA）技术。CBA的原理是将包被某种抗原或抗体的不同大小的微球与待测液体中的相应成分反应形成抗原与抗体的复合物，再加入荧光素标记的第二抗体，微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系，由此可对待测液体中与微球上包被抗原或抗体分子相对应的成分进行定性或定量分析，例如同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子，同时测定血清中多种自身抗体。CBA发展的时间虽很短，目前所能检测的项目还不多，但极具发展潜力。已知检测细胞因子的方法有多种，包括靶细胞功能分析法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶免疫分析（Elispots）等，但CBA与之相比，其灵敏度极高、可达2pg/ml，而且能同时测定单个标本中的多种细胞因子。

六．流式分子表型分析

流式分子表型分析（Molecular phenotyping）是指用流式细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免疫表型分析技术相结合，对于检测所选择细胞亚群的特异性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）检测，提供了一种非常有用的工具，具有广阔的应用前景。流式分子表型与免疫表型结合分析的基本技术路线是：

①待测细胞首先与特异性细胞亚群的单克隆抗体反应。
　　②固定并渗透细胞。
　　③通过PCR进行引物特异的核酸序列扩增。
　　④应用对扩增产物的特异性寡核苷酸荧光素标记探针进行荧光原位杂交（FISH）。
　　⑤加入针对细胞亚群单抗的荧光素标记的第二抗体。
　　⑥流式细胞仪检测及数据分析。例如，流式细胞免疫表型与聚合酶链反应及荧光原位杂交（PCR-FISH）结合测定血液CD4⁺细胞中HIV特异的DNA或RNA，对于AIDS的病程监测、治疗反应及预后等有重要价值。流式荧光原位杂交（Flow-FISH）法测定染色体端粒长度：细胞的染色体端粒是由2～20 Kb串联的短片段重复序列（TTAGGG）n和一些结合蛋白组成，端粒长度越长，所含重复碱基数目越多；用荧光素标记的核酸-（CCCTAA）3端粒序列特异性探针进行FISH后经流式细胞仪检测，其荧光强度的高低可反映端粒的长短；Flow-FISH可测出小于3Kb的端粒长度差，对肿瘤的发生与发展、治疗与预后等的研究有一定价值。

以上几个方面的进展代表了当前临床流式细胞分析的发展的主要趋势，对今后进一步开展临床流式细胞分析将有一定的指导作用。