简介
滤泡辅助性 T 细胞 (T follicular helper cells, Tfh) 染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行染色，以进一步深入研究该群细胞的表型和功能。
原理
滤泡辅助性 T 细胞染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析，以鉴定 Tfh，便于进一步深入研究该群细胞的表型和功能。Tfh 是新近确定的 一个 CD4+T 细胞亚群，其表面标志是表达 CD4 和趋化因子受体 CXCR5(CD3+ CD4+ CXCR5+)。 Tlh 是辅助 B 细胞发挥体液免疫应答效应的主要细胞亚群。
材料与仪器
器材：
流式细胞仪、单染管、离心机
试剂：
① 荧光标记的特异性单克隆抗体及同型对照抗体；
②细胞洗液。含 2% BSA、0.2% NaN3 的 PBS，固定液（1% 多聚甲醛 PBS，pH7.2）；
③人丙球蛋白。
耗材：
流式专用样品管、玻璃管
步骤
滤泡辅助性 T 细胞染色技术的基本过程可分为如下几步：
（1）人外周血单个核细胞（PBMC）分离。
（2）用流式洗液调整 PBMC 悬液密度为 2 x 108 L-，取 25μl 细胞悬液加入 1 μg 人丙球蛋白，室温封闭 15 min。
（3）加入 10 μl Percp-CXCR5 mAb，4 ℃ 孵育 30 min。
（4）同时加入 FITC-CD4 及 PE-CD19 mAb 各 20 μl，对照管分别加入各色的同型对照 mAb，各色单染管用于补偿调节，4 ℃ 孵育 30 min。
（5）每管加入 PBS 洗液 3 ml，1500 r/min 离心 5 min，弃上清。
重复洗 1 遍，加入 400 μl 流式固定液悬浮细胞，上机检测。
（6）所有样品用 BD FCS Calibor 进行分析，用 488 nm 激发光，前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）以线性信号收集。FSC-SSC 散点图上圈出单个核细胞群，用补偿管调节消除各色之间的荧光重叠，检测各色荧光强度，测定时各荧光通道均以相应同种型（isotype）IgG 染色细胞作阴性对照。
注意事项
1. 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠 细胞和细胞碎片。
2. 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧 光抗体的本底对照。
常见问题
判定结果时，为使免疫荧光的定量分析更精确，注意减去本底荧光，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。
来源：丁香实验
