简介
Treg 细胞染色技术是指先对细胞进行固定、破膜处理后，通过鉴定细胞因子特异性染色的荧光信号，分选和鉴定 Treg 细胞。
原理
Treg 细胞染色技术的原理是通过鉴定细胞因子特异性染色的荧光信号，来分选和鉴定 Treg 细胞。预先对细胞进行固定既可以保持细胞形态和细胞内的抗原性，又可以使细胞对随后的破膜过程产生耐受。破膜过程可以使荧光标记的细胞因子抗体穿过细胞膜和细胞器膜，与细胞因子进行特异性地结合，从而产生荧光信号，可通过流式细胞仪进行检测。
材料与仪器
器材：
① 流式专用样品管、离心机、玻璃管；
② 流式细胞仪（本实验室为 BD FCS Calibor）。
试剂：
① 一抗以及荧光素标记的二抗、同型对照抗体；
② 细胞洗液。含 2% BSA，0. 2% NaN3 的 PBS，固定液（1% 多聚甲醛 PBS，pH7.2）；
③ 破膜剂。
步骤
Treg 细胞染色技术的基本过程可分为如下几步：
（1）人外周血单个核细胞（PBMC）的分离
（2）细胞表面染色
① 分别取 10μl 标记抗体 CD4 及 CD25 加入流式管底，加入 100 μl 待测细胞，混匀，4 ℃ 避光反应 30 min，同时设置补偿管和同型对照。
② 加入 2 ml 流式洗液，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。
（3）固定和破膜
① 向上述表面染色后的细胞中加入 500 μl 4 ℃ 预冷的固定液，混匀，4 ℃ 避光反应 30 min。
② 加入 2 ml 破膜剂，1500 r/min 离心 5 min，弃上清。
③ 加入 2 ml 破膜剂重悬细胞，1500 r/min 离心 5 min，弃上清。
（4）细胞内染色
① 向每管加入 10 μl 荧光标记胞内抗体 Foxp3，4 ℃ 避光反应 30 min。
② 每管加入 1 ml 破膜剂重悬细胞，1000 r/min 离心 5 min，弃上清。
③ 加入 0.3 ml 流式洗液重悬细胞。
（5）流式细胞仪获取及结果分析
① 所有样品用 BD FCS Calibor 进行分析，用 488nm 激发光，前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）以线性信号收集，得到 FSC-SSC 散点图，其上圈出单个核细胞群，用补偿管调节消除各色之间的荧光重叠，检测各色荧光强度，测定时各荧光通道均以相应同种型 lgG 染色细胞作阴性对比。
② 结果分析用 CellQuest 软件，再 FSC-SSC 散点图上选定淋巴细胞群并以此群细胞设门，分析 CD4+ 和 CD25+ 细胞群表达率。
注意事项
1. 染色时要避光，防止荧光素淬灭。
2. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
3. 上机获取时要仔细调节补偿管，确保 Foxp3 阳性率。
来源：丁香实验
