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Treg细胞染色技术

相关实验:T淋巴细胞亚群染色技术

最新修订时间:

简介

Treg 细胞染色技术是指先对细胞进行固定、破膜处理后,通过鉴定细胞因子特异性染色的荧光信号,分选和鉴定 Treg 细胞。

原理

Treg 细胞染色技术的原理是通过鉴定细胞因子特异性染色的荧光信号,来分选和鉴定 Treg 细胞。预先对细胞进行固定既可以保持细胞形态和细胞内的抗原性,又可以使细胞对随后的破膜过程产生耐受。破膜过程可以使荧光标记的细胞因子抗体穿过细胞膜和细胞器膜,与细胞因子进行特异性地结合,从而产生荧光信号,可通过流式细胞仪进行检测。

材料与仪器

器材:


① 流式专用样品管、离心机、玻璃管;


② 流式细胞仪(本实验室为 BD FCS Calibor)。


试剂:

① 一抗以及荧光素标记的二抗、同型对照抗体;

② 细胞洗液。含 2% BSA,0. 2% NaN3 的 PBS,固定液(1% 多聚甲醛 PBS,pH7.2);

③ 破膜剂。

步骤

Treg 细胞染色技术的基本过程可分为如下几步:

(1)人外周血单个核细胞(PBMC)的分离

(2)细胞表面染色

① 分别取 10μl 标记抗体 CD4 及 CD25 加入流式管底,加入 100 μl 待测细胞,混匀,4 ℃ 避光反应 30 min,同时设置补偿管和同型对照。

② 加入 2 ml 流式洗液,1000 r/min 离心 5 min,弃上清。

(3)固定和破膜

① 向上述表面染色后的细胞中加入 500 μl 4 ℃ 预冷的固定液,混匀,4 ℃ 避光反应 30 min。

② 加入 2 ml 破膜剂,1500 r/min 离心 5 min,弃上清。

③ 加入 2 ml 破膜剂重悬细胞,1500 r/min 离心 5 min,弃上清。

(4)细胞内染色

① 向每管加入 10 μl 荧光标记胞内抗体 Foxp3,4 ℃ 避光反应 30 min。

② 每管加入 1 ml 破膜剂重悬细胞,1000 r/min 离心 5 min,弃上清。

③ 加入 0.3 ml 流式洗液重悬细胞。

(5)流式细胞仪获取及结果分析

① 所有样品用 BD FCS Calibor 进行分析,用 488nm 激发光,前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)以线性信号收集,得到 FSC-SSC 散点图,其上圈出单个核细胞群,用补偿管调节消除各色之间的荧光重叠,检测各色荧光强度,测定时各荧光通道均以相应同种型 lgG 染色细胞作阴性对比。

② 结果分析用 CellQuest 软件,再 FSC-SSC 散点图上选定淋巴细胞群并以此群细胞设门,分析 CD4+ 和 CD25+ 细胞群表达率。

注意事项

1. 染色时要避光,防止荧光素淬灭。
2. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
3. 上机获取时要仔细调节补偿管,确保 Foxp3 阳性率。

来源:丁香实验

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