总DNA质量检测及酶切
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实验步骤:
1.取 10μl DNA 于 0.8% 凝胶检测;
2.将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/μl;
3.仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度( 10U-50U/μl )厂家配套试剂;
4.计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:( 0.5 ml tube 中)
DNA(3-5μg) 10μl
10 × buffer reaction 1.5μl
Enzyme (15 U/μl) 0.8μl (冰上)
ddH2O 2.7μl
混匀,短暂离心;
5.37 ℃ 温浴 1-2 hrs ( 纯 DNA) 或 10 hrs (粗制 DNA );
6.加入上样缓冲液终止酶切反应,也可 65 ℃加热 10 min 使酶变性失活;
7.电泳检测酶切效率:
每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。
结果分析:
若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片,则酶切效果好,否则需重做;
DNA 被切烂: DNA 降解,重新提 DNA ;
DNA 切不动:杂质多(多糖,蛋白质,酚类,有机溶剂等),重新纯化;
若是 BAC 克隆 DNA ,酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。
思考:
1.什么是酶星活性?如何避免?
2.影响酶切效率的因素?
3.EB 指示剂原理?