FITC标记抗体-Chadwick氏法
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试剂:
抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、pH8.0的0.01mol/L PBS、1%硫柳汞。
材料:
离心机及离心管、三角烧瓶(25ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯(500ml)等。
方法与步骤:
1. 抗体的准备。用0—4℃ pH8.0的PBS将免疫球蛋白溶液浓度稀释为30—40mg/ml,置于三角烧瓶内,放入冰槽中;
2. 荧光素的准备。按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光素计算,称取所需的荧光素量,用3%重碳酸钠水溶液溶解;
3. 将上述已准备好的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅拌,使其在0—4℃冰箱中结合18—24h;
4. 透析。荧光素与球蛋白结合完毕后,将球蛋白的溶液以2500r/min离心20min,除去其中少量的沉淀物后,装入透析袋中再置于烧杯中,在0—4℃下用pH8.0的缓冲盐溶液透析过夜;
5. 过柱。取透析过夜的标记物,过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱,分离出游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。