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荧光素FITC标记抗体的方法(Marsshall法、Chadwick法、改良法、透析标记法)

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当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般最多能结合15~20个,一个IgG分子可结合2~8个分子的FITC,其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H 2 -蛋白质 → FITC-NS-C-N-H 2 -蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1 Marsshall
(1)材料抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、50mL小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/L PBS等。
(2)方法及步骤
①抗体的准备
取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为20mg/mL,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
②荧光素的准备
根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量。
a.蛋白溶液:含量Amg/mL;容积BmL。
b.总蛋白量(AXB)=Crag。
c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/mL,用C/10;如高于20mg/mL,用C/20)。
d.荧光素FITC的量:(1/50~2/100)×C=Emg。
e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D/10=FmL。
f. PBS量D-(B+F)=GmL。
注:A为蛋白含量,mg/mL;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mg;D为常数,mg;正为荧光素的量,mg;F为碳酸盐缓冲液的容积,mL;G为PBS的容积,mL。
③结合(或标记) 
边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5-10min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析
结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0~4℃)过夜。
⑤过柱
取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量:12mL标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20mL(稀释1.7倍左右)。
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