荧光素FITC标记抗体的方法（Marsshall法、Chadwick法、改良法、透析标记法）
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当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H 2 -蛋白质 → FITC-NS-C-N-H 2 -蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1 ． Marsshall 法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0.5mol／L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50mL小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／L PBS等。
(2)方法及步骤
①抗体的准备
取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／mL，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备
根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／mL；容积BmL。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／mL，用C／10；如高于20mg／mL，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)×C＝Emg。
e．巳0.5mol／L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D／10＝FmL。
f． PBS量D-(B+F)=GmL。
注：A为蛋白含量，mg／mL；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，mL；G为PBS的容积，mL。
③结合(或标记)
边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5-10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析
结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析(0～4℃)过夜。
⑤过柱
取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.2)；过滤量：12mL标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20mL(稀释1.7倍左右)。
FITC-N=C=S + N-H 2 -蛋白质 → FITC-NS-C-N-H 2 -蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1 ． Marsshall 法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0.5mol／L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50mL小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／L PBS等。
(2)方法及步骤
①抗体的准备
取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／mL，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备
根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／mL；容积BmL。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／mL，用C／10；如高于20mg／mL，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)×C＝Emg。
e．巳0.5mol／L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D／10＝FmL。
f． PBS量D-(B+F)=GmL。
注：A为蛋白含量，mg／mL；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，mL；G为PBS的容积，mL。
③结合(或标记)
边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5-10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析
结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析(0～4℃)过夜。
⑤过柱
取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.2)；过滤量：12mL标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20mL(稀释1.7倍左右)。
