FITC标记抗体-Marsshall氏法
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材料:
抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25—50ml)、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉线及烧杯(500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
方法与步骤:
1. 抗体的准备。量取适量已知浓度的球蛋白溶液,置入三角烧瓶中,加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最终球蛋白浓度为20mg/ml,缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将三角烧瓶置冰槽中,电磁搅拌速度适当,即以不起泡沫为宜搅拌5—10min;
2. 荧光素的准备。根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克蛋白加0.01mg荧光素的比例,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末;
3. 结合(或称标记)。将称取的荧光色素缓慢加入到球蛋白溶液中,并不停地搅拌,避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻璃棒上,在大约5—10min内加完。然后继续搅拌12—18h。因荧光素与球蛋白结合期间要求必须保持蛋白溶液于4℃左右,所以需要即使地添冰或去水。亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中;
4. 透析。荧光素与球蛋白结合完毕后,将球蛋白的溶液以2500r/min离心20min,除去其中少量的沉淀物后,装入透析袋中再置于烧杯中,在0—4℃下用pH8.0的缓冲盐溶液透析过夜;
5. 过柱。取透析过夜的标记物,过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱,分离出游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。