材料与仪器
白鼠
敌百虫、苦味酸
鼠笼 动物天平 注射器 电子计算器
敌百虫、苦味酸
鼠笼 动物天平 注射器 电子计算器
步骤
1. 预备实验
①摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（Dm）和一个 动物也不死亡的最大剂量(Dn)。方法是据经验或文献定出一个估计量， 观察 2～3 只动 物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出 Pm = 100% 和 Pn = 0% 的剂量，此两量分别为上下限。
②确定组数，组距及各组剂量
组数：一般 5-8 组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定 5 组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。
组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。d 不宜过大，因过大可使标准 误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组 距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或 减少）而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变 化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可做为敏感性大小的标志。距离大，说 明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求 d 应小于 0.155，多在 0.08～0.1 之间。
确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为 X k, 下限剂 量的对数值为 X1，组数为 g 则：
确定各组剂量：由Ｘ１逐次加逐 d(或 X k 逐次减 d）， 得出各组剂量的对数值，再分 别查反对数：即得出各组剂量（呈等比级数排列）。
③配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如 0.5 ml/20 g）。
2. 正式实验
①实验动物的选择与分组 选择原则：可据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考
虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。LD50 常用小白鼠进行实验来测得。 分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数， 就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共 8 组，每组 10 只动物，高剂量三个组的死亡数分别为 6、9、10，但如每组只用 6 只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是 6。）我们此次实验将动 物分成 7 组，每组 10 只小鼠。
分组方法：见附录，实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编 组，然后按体重分群，再随机分组，力求使各组平均体重相等。我们此次实验直接按体 重分群，再随机分组。
②给药、观察死亡数、求出死亡率 给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。我们此次实验采取腹腔注射的方法。
给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共 7 组，先按 2、4、6 组顺序给药，然后逆行按 7、5、3、1 组的顺序给药。这样可避免因药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。 而且当第３组给药后，如第 2 组动物已经全死，则可省下第 1 组动物及 1 号药液。如第 7 组已死亡，可补做第 8 组，争取做出 0％死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体 重或平均体重确定。我们此次实验各组动物同时给药。
观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡，一般需要观察一周时间。我们此次实验 观察一小时。
最后将死亡情况及各种数据填入下表（4-4）中。
3. 计算公式
为了解 LD50 测定原理，首先需了解剂量与反应的关系。某被试因素对动物的毒性也 是一种反应，其大小往往以其使动物致死的量表示。致死量小说明毒性大，反之说明毒 性小。根据剂量与反应的关系，可绘出剂量反应曲线（量效曲线）。图（4-16）中表示的 是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线，它们具有如下特点：
1. 剂量与死亡频数的关系：是一条中间高，两侧低，右侧延长较远的曲线（图 4-16a）
2. 对数剂量与死亡频数的关系：是正态分布曲线（图 4-16ｂ）。
3. 剂量与死亡率的关系：是一条长尾“Ｓ”形曲线（图 4-16ｄ）。
4. 对数剂量与死亡率的关系：是一正“Ｓ”形曲线（图 4-16ｃ）。 从对数剂量与死亡频率的正态分布中（4-16b）可见，Lo gLD50 恰在正态曲线中点所对应的横轴上，按此剂量给药动物恰好死亡一半。因在正态曲线中，其中点恰是均数所在处，所以 Lo gLD50 就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值（也是真数剂量的几 何平均值）。从对数剂量与死亡率关系的正Ｓ形曲线（图 4-16c）中可见，Lo gLD50 恰为正 Ｓ形曲线中点所对应的横轴上的对数值， 因此正Ｓ形曲线中点对应的纵轴（死亡率）恰 为 50％。这条曲线的特点是：①死亡率为 50％（即 LD50）时的斜率最大，由于其位于曲 线中央，故灵敏度最高。②曲线两端平坦，接近 0％或 100％附近灵敏度最差，剂量不易 确定，而且即使确定了也常不可靠。所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指 标是恰当的。总之，如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正Ｓ形曲线中点 所对应的横轴上的对数植，即可求出 Lo gLD50 及 LD50。
公式推导：根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线，通过面积法可得出公式：
图中横座标为对数剂量Ｘ，纵座标为死亡率Ｐ， g为正Ｓ形曲线中点，它对应的纵 座标Ｈ点Ｐ＝50％，横座标Ｆ点Ｘ＝LogLD50,Ａ点Ｐ＝0％＝0，Ｄ点Ｐ＝100％＝１，Ｂ 点 X k 为 P=100%的对数剂量。
由图可知：矩形 AFED=AF·AD=LogLD50×1=LogLD50.
又：曲边△Ｘ１Ｆ g≅ 曲边△ gＣＥ（二边一角相等）
∴矩形ＡＦＥＤ＝曲边形ＡＸ１ＣＤ＝LogLD50
则 LogLD50＝矩形ＡＸkＣＤ－曲边形Ｘ１ＸkＣ。
∵曲边形Ｘ１ＸkＣ相当于多个梯形面积之总合。
∴曲边形Ｘ１ＸkＣ＝ d·Σ(Pi+Pi+1)
又矩形 AX kCD = AX k·AD=X k·1=X k
∴Lo gLD50 = Xk－dΣ(Pi+Pi+1).
上述推导过程用直观图表示：LgLD50
公式演变：
①摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（Dm）和一个 动物也不死亡的最大剂量(Dn)。方法是据经验或文献定出一个估计量， 观察 2～3 只动 物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出 Pm = 100% 和 Pn = 0% 的剂量，此两量分别为上下限。
②确定组数，组距及各组剂量
组数：一般 5-8 组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定 5 组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。
组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。d 不宜过大，因过大可使标准 误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组 距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或 减少）而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变 化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可做为敏感性大小的标志。距离大，说 明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求 d 应小于 0.155，多在 0.08～0.1 之间。
确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为 X k, 下限剂 量的对数值为 X1，组数为 g 则：
确定各组剂量：由Ｘ１逐次加逐 d(或 X k 逐次减 d）， 得出各组剂量的对数值，再分 别查反对数：即得出各组剂量（呈等比级数排列）。
③配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如 0.5 ml/20 g）。
2. 正式实验
①实验动物的选择与分组 选择原则：可据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考
虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。LD50 常用小白鼠进行实验来测得。 分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数， 就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共 8 组，每组 10 只动物，高剂量三个组的死亡数分别为 6、9、10，但如每组只用 6 只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是 6。）我们此次实验将动 物分成 7 组，每组 10 只小鼠。
分组方法：见附录，实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编 组，然后按体重分群，再随机分组，力求使各组平均体重相等。我们此次实验直接按体 重分群，再随机分组。
②给药、观察死亡数、求出死亡率 给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。我们此次实验采取腹腔注射的方法。
给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共 7 组，先按 2、4、6 组顺序给药，然后逆行按 7、5、3、1 组的顺序给药。这样可避免因药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。 而且当第３组给药后，如第 2 组动物已经全死，则可省下第 1 组动物及 1 号药液。如第 7 组已死亡，可补做第 8 组，争取做出 0％死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体 重或平均体重确定。我们此次实验各组动物同时给药。
观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡，一般需要观察一周时间。我们此次实验 观察一小时。
最后将死亡情况及各种数据填入下表（4-4）中。
3. 计算公式
为了解 LD50 测定原理，首先需了解剂量与反应的关系。某被试因素对动物的毒性也 是一种反应，其大小往往以其使动物致死的量表示。致死量小说明毒性大，反之说明毒 性小。根据剂量与反应的关系，可绘出剂量反应曲线（量效曲线）。图（4-16）中表示的 是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线，它们具有如下特点：
1. 剂量与死亡频数的关系：是一条中间高，两侧低，右侧延长较远的曲线（图 4-16a）
2. 对数剂量与死亡频数的关系：是正态分布曲线（图 4-16ｂ）。
3. 剂量与死亡率的关系：是一条长尾“Ｓ”形曲线（图 4-16ｄ）。
4. 对数剂量与死亡率的关系：是一正“Ｓ”形曲线（图 4-16ｃ）。 从对数剂量与死亡频率的正态分布中（4-16b）可见，Lo gLD50 恰在正态曲线中点所对应的横轴上，按此剂量给药动物恰好死亡一半。因在正态曲线中，其中点恰是均数所在处，所以 Lo gLD50 就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值（也是真数剂量的几 何平均值）。从对数剂量与死亡率关系的正Ｓ形曲线（图 4-16c）中可见，Lo gLD50 恰为正 Ｓ形曲线中点所对应的横轴上的对数值， 因此正Ｓ形曲线中点对应的纵轴（死亡率）恰 为 50％。这条曲线的特点是：①死亡率为 50％（即 LD50）时的斜率最大，由于其位于曲 线中央，故灵敏度最高。②曲线两端平坦，接近 0％或 100％附近灵敏度最差，剂量不易 确定，而且即使确定了也常不可靠。所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指 标是恰当的。总之，如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正Ｓ形曲线中点 所对应的横轴上的对数植，即可求出 Lo gLD50 及 LD50。
公式推导：根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线，通过面积法可得出公式：
图中横座标为对数剂量Ｘ，纵座标为死亡率Ｐ， g为正Ｓ形曲线中点，它对应的纵 座标Ｈ点Ｐ＝50％，横座标Ｆ点Ｘ＝LogLD50,Ａ点Ｐ＝0％＝0，Ｄ点Ｐ＝100％＝１，Ｂ 点 X k 为 P=100%的对数剂量。
由图可知：矩形 AFED=AF·AD=LogLD50×1=LogLD50.
又：曲边△Ｘ１Ｆ g≅ 曲边△ gＣＥ（二边一角相等）
∴矩形ＡＦＥＤ＝曲边形ＡＸ１ＣＤ＝LogLD50
则 LogLD50＝矩形ＡＸkＣＤ－曲边形Ｘ１ＸkＣ。
∵曲边形Ｘ１ＸkＣ相当于多个梯形面积之总合。
∴曲边形Ｘ１ＸkＣ＝ d·Σ(Pi+Pi+1)
又矩形 AX kCD = AX k·AD=X k·1=X k
∴Lo gLD50 = Xk－dΣ(Pi+Pi+1).
上述推导过程用直观图表示：LgLD50
公式演变：
来源：丁香实验
