DNA测序结果判读及常见问题分析
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测序结果的判读
测序结果为.abi格式,可用软件chrosmas打开
一种颜色的峰代表一个碱基,峰的高低表信号的强弱。一个正常的N表示机器没法判读是哪种碱基,原因是:杂峰的信号高于机器默认的值,机器会认为该处有两个峰,因此不能判断确定是哪个峰,需要人工判读。以下三种情况会出现N:有杂合子,有杂峰,反应已结束。
原因:测序产物纯化不够
注意:染料峰位于序列的前 100 碱基以内;酒精峰位于序列的 220 ~ 320 碱基之间
产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒
原因:测序反应失败。
解决办法:改进条件,重做反应。注意两个关键因素:引物与模板之间的比例: 3.2 pmol: 200 ng 。模板 DNA 的纯度和用量: 1.6 ~ 2.0
原因:残余的 Dye 太多,纯化不够。有测序反应,但效率低下信号太弱
解决办法:纯化充分。避开引物峰,确定新的分析起点