常见问题 | 具体情况 | 可能的原因 | 处理办法 | 备注 |
样品准备问题 | 菌培养不好或失败 | 抗性不对或菌已死 | 核对抗性，尽可能提供载体信息。 | |
或菌培养条件特殊 | 重新提供菌液，或提供2μg纯化质粒。 |
质粒提不出 | 质粒拷贝数极低或 | 客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。 | |
培养方式不当 |
质粒产量很低 | 低拷贝数质粒或 | 客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。 | |
培养方式不当 |
自带质粒或已纯化PCR产物量极低 | 是否为电泳法定量， | 质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。 | 测OD值法不可靠,电泳检测 |
总量是否足够 | 已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。 |
测序出现双峰或信号中断 | 双峰 | 重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复 | 用反向引物测互补链。 | 此类问题主要与样品有关 |
质粒测序在插入序列中出现套峰 | 可能是样品非单克隆，挑其他测序。 |
PCR产物测序中，某一点后序列变乱 | 可能是存在移码突变，这是正常的，也可以后测序。 |
PCR产物中一个或多个位置有套峰 | 序列中存在突变，这是正常的，也可以后进行测序。 |
PCR产物测序前部分双峰 | 引物二聚体污染或产物不纯，后测序。 |
质粒测序时整个结果双峰 | 引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。 |
质粒和PCR产物测序出现双峰 | 引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。 |
信号迅速衰减或中断 | 模板GC二级结构区后 | 难以得到好的测序结果，亚成较小的片段进行测序 | |
模板GT二级结构区后 | 测反向互补序列，AC结构不影响测序 | |
严重的重复结构 | 测反向互补序列 | |
模板特性决定的 | 根据具体情况决定 | |
信号极弱或无信号 | 模板质量差 | 重新提供菌液或纯化PCR产物 | |
质粒样品：引物不符 | 尽量提供载体详细信息，核查引物 | |
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引物不适宜测序 | 测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议到载体上用通用引物进行测序 | |
质粒产量极低 | 客户自己提供2μg纯化好的质粒 | |
PCR产物定量极低 | 重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化 | |
测序结果正常，与预期不符 | 找不到引物 | 质粒模板 | 检测是否为空载体，从其互补链上寻找，位点离测序引物太近，长插入片段未测通。 | |
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PCR模板 | 不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经后进行测序。 |
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结果完全不对 | 请提供详细资料我们会根据结果具体分析。 |
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