PCR扩增产物的RFLP分析
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一、PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解
将PCR扩增产物分装，并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切
DR1 ：Ava II，Pst I
DR2 ： Fok I，Sau 96，HpH I
DR3 、8、11、12、14： Ava II，Fok I，Kpn I，Hae II，Sau96，SfaN I，Sac II，Apa I
（1）将8ul PCR扩增产物与1ul相应的酶切缓冲液混合。
（2）取1ul相应的核酸内切酶（含1~2单位）。
（3）用吸头混匀。
（4） 在适当的温度中酶切1~3小时，为了确定DNA是否完全酶解，可以在酶切缓冲液中加入具有相应酶切位点的对照DNA（已知长度、酶切位点的数目和位置、酶切后的条带）。
二、PCR扩增产物酶解后的聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR扩增产物经上述限制性核酸内切酶酶切后，一般用水平电泳装置和12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。
（1） 聚丙烯酰胺电泳凝胶的制备。
12%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
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凝胶成分
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凝胶体积（ml）
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||||
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125
|
100
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80
|
40
|
25
|
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10×TBE
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12.5
|
10
|
8
|
4
|
2.5
|
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双蒸水
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38.15
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30.52
|
24.4
|
12.2
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7.63
|
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30%丙烯酰胺
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40.5
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38.75
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31
|
15.5
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9.69
|
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2%双丙烯酰胺
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25
|
20
|
16
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8
|
5
|
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10%过硫酸铵（新鲜配制）
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0.875
|
0.7
|
0.56
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0.28
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0.175
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四甲基乙二胺（TEMED）
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0.043
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0.035
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0.028
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0.014
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0.009
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（2） 在酶解后的PCR扩增产物中加入8 ul 的加样缓冲液（0.05%丫啶橙，40%蔗糖），用加样器混匀。
（3） 将样本加入凝胶加样孔中，2000 V 电泳2.5~3小时。
（4） 用溴化乙锭或银染法显示DNA电泳条带。
