PCR扩增产物的RFLP分析
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一、PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解
将PCR扩增产物分装,并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切
DR1 :Ava II,Pst I
DR2 : Fok I,Sau 96,HpH I
DR3 、8、11、12、14: Ava II,Fok I,Kpn I,Hae II,Sau96,SfaN I,Sac II,Apa I
(1)将8ul PCR扩增产物与1ul相应的酶切缓冲液混合。
(2)取1ul相应的核酸内切酶(含1~2单位)。
(3)用吸头混匀。
(4) 在适当的温度中酶切1~3小时,为了确定DNA是否完全酶解,可以在酶切缓冲液中加入具有相应酶切位点的对照DNA(已知长度、酶切位点的数目和位置、酶切后的条带)。
二、PCR扩增产物酶解后的聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR扩增产物经上述限制性核酸内切酶酶切后,一般用水平电泳装置和12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。
(1) 聚丙烯酰胺电泳凝胶的制备。
12%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制
凝胶成分
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凝胶体积(ml)
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||||
125
|
100
|
80
|
40
|
25
|
|
10×TBE
|
12.5
|
10
|
8
|
4
|
2.5
|
双蒸水
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38.15
|
30.52
|
24.4
|
12.2
|
7.63
|
30%丙烯酰胺
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40.5
|
38.75
|
31
|
15.5
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9.69
|
2%双丙烯酰胺
|
25
|
20
|
16
|
8
|
5
|
10%过硫酸铵(新鲜配制)
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0.875
|
0.7
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0.56
|
0.28
|
0.175
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四甲基乙二胺(TEMED)
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0.043
|
0.035
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0.028
|
0.014
|
0.009
|
(2) 在酶解后的PCR扩增产物中加入8 ul 的加样缓冲液(0.05%丫啶橙,40%蔗糖),用加样器混匀。
(3) 将样本加入凝胶加样孔中,2000 V 电泳2.5~3小时。
(4) 用溴化乙锭或银染法显示DNA电泳条带。