PCR扩增产物的电泳分析

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。

一、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。

1、凝胶浓度

凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定。

琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

2、电泳缓冲液

核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解。

10XTBE缓冲液的配制：Tris硷，108克 EDTA，9.3克 硼酸，55克 H2O至，1000ul (其PH应为8.0～8.2) 临用时用水稀至0.5XTBE(20倍稀释。

3、核酸电泳的指示剂与染色剂

1）指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色。

溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。

二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。

指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。

2）染色剂：核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。

溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。

银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。

4、电泳

1）电泳装置：电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等。

2）电泳方法

①用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。

②根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳。

③配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化。冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固。

④向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。

⑤在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

⑥接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)。电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。

⑦根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可。

3）溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.。