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RFLP 法分析 APOE 基因型

最新修订时间：

材料与仪器

溶解于 TE 缓冲液(pH 7.4)的 3〜5ng ul gDNA(来自血液）
APOE 引物 4dNTP 混合物 Taq 酶 二甲基亚砜 10 X PCR 缓冲液 10 X TBE 溴化乙锭 6X 上样缓冲液

步骤

1.设置PCR体系(按25juJ体系计算） ： gDNA(用 3〜5ng/pl gDNA) 15〜25ng; 前向引物12. 5pmol; 反向引物12.5pmol; 各 dNTP 6. 25nmol; T叫 酶 I. 25U; 加 DMSO至 10%终浓度； I X PCR 缓冲液(含 15mmol/L MgCl2) 。 2. PCR参数： 起始步骤： IOmin 94°C(变性) 32个循环： 30s 94°C (变性) 30s 56°C (退火) Imin 72°C (延伸) 最终步骤： 4min 72°C (延伸) 3.在 25julP C R 产物中加人5U I 酶及缓冲液C (终浓度为1X )，37°C 孵育2〜3h。 4•配制4% 的琼脂糖胶:将I. 5g低熔点琼脂糖和4. 5g NuSieve琼脂糖溶解于15〇ml T B E 中，混合后微波炉中加热至琼脂溶解，加 15〇 W lOmg/ml溴化乙锭（〇 . 15mg)并 、 混 匀，立即倒人胶盒中，插入梳子(15〜20个上样孔） 。 5.胶凝固后，覆盖上1X T B E ，小心拔掉梳子，每个上样孔中加入IOpJ裂解P C R 产物(第 3 步)和2^1上样缓冲液。 6.125V 电压电泳45min，通过片段长度分析A P O E 的基因型。 备选方案1 反向杂交A P O E 基因图谱 材料 溶解于T E 缓冲液(PH7. 4 ,附录1)的 3〜SngyVl gDNA(来自血液） I N NOLiPA ApoE 试剂盒(Innogenetics 公司） 包括： ApoE扩增缓冲液 ApoE引物混合物 MgCl2溶液 甘油 膜条 杂交缓冲液 严格冲洗液 变性液 底物偶合物 稀释偶合物
底物溶液 底物缓冲液 冲洗液 检测槽 D N A 聚合酶(R oche) 振摇式45° C 水浴槽 局质量标准温度计 1. P C R 扩增体系^ oju丨体系） ： g D N A (用 3〜5ng/y g D N A ) 15〜25ng; 扩增缓冲液IOjuI; A p o E 引物混合物 MgCl2溶液 IOjuI; 甘 油 IOjuI; T 叫 酶 1U 。 2. P C R 参数。 起始步骤： 5min 95°C (变性） 3〇个循环 30s 95°C (变性） 2〇 s 60°C (退火） 20s 72°C (延伸） 最终步骤 IOmin 72°C (延伸） 3•在检测槽中混合IOjuI P C R 产物和IOjul变性液，室温下孵育5min。 下 述 实 验 步 骤 中 的 孵 育 、洗 涤 和 冲 洗 步 骤 等 ，都 在 Im I 的 体 积 中 进 行 ，并 始 终 置 于 水 浴 摇 床 中 ；同 一 个 检 测 槽 中 ，在 先 前 的 成 分 移 走 后 才 加 后 面 的 成 分 。 4•混合变性D N A 和配好备用的杂交缓冲液，将膜浸人其中45<> C (用标准温度计测 量)30mino 5. 将膜置于45°C(准确） 的洗涤液中，第一次1〇〜2〇 s，第二次l〇min。 6. 室温下，将膜置于I : 5(如 2 0 % 冲洗液/80%水)溶液中冲洗两次，每次im in。 7. 加 Iml 1 : 100的偶联溶液至各检测槽，室温下孵育膜3〇 min。 8. 室温下，将膜置于1 :5 的冲洗液中冲洗两次，每次lmin。 9•将膜置于配好备用的底物溶液中，室温下孵育lmin。 10. 加 Iml 1 : 100的底物溶液至各检测槽，室温下孵育膜30min。 11. 室温下用水洗膜两次，每次3min。 12. 根据膜上条带的特征确定各自A P O E 的基因型。 备选方案2 劳光偏振法(fluorescence polarization，F P )检测APO E的 基因型 材 料 (标 V 的 条 目 参 见 附 录 1) 溶解于T E 缓冲液(p H 7.4,附录1)的 3〜Sng/jul g D N A (来自血液）
A PO E引物： 前向引物:5'-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3' 反向引物:5'-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC-3' V^Ommol/L 4dNTP 混合物(Roche;每 dNTP 浓度为 10mmol/L) 5U/jul Tag 酶 (Roche) 二甲基亚砜（ 出11161； ]1713111£〇 又丨 €16， 〇]\48〇) 含 15mmol/L MgCl2的 IOXPCR 缓冲液(Roche) E x o - S A P - I T ( U S B ) 扩 增 SN P 的寡核苷酸引物(延伸反应） ： 5，-GGC GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3'(APOE112) 5，-CGG CCT GGT ACA CTG CCA G G C ^(A PO E158) AcycloPrime-FP SNP 检测试剂盒(Perkin-Elmer Life Science)包 括 ： IOX缓冲液 AcycloTerminator 混合物 AcycloPol DNA 聚合酶 96 孔板（ MJ Research) 96孔 板 PCR仪 80°C水浴箱 96孔板突光偏振检测设备(如 Perkin-Elmer Life Science公 司 V ictor系列） L 在 96孔板中准备PCR扩增体系（ 30^1体系） ： gDNA(用 3〜^ng/jul gDNA) 30〜50ng; APOE前 向 引 物 6pmol; APOE反 向 引 物 6pmol; 各 dNTP 0. 5nmol; T叫 酶 I. 25U; DMSO 至终浓度 10% (V /Y ); 含 I. 5mmol/L MgCl2的 I XPCR 缓冲液。 3 4 5 2. PCR参 数 ： 起始步骤： IOmin 94°C(变性) 32个循环： 30s 94°C (变性) 30s 56°C (退火) Imin 72°C (延伸) 最终步骤： 7 min 72°C (延伸) 3 .每孔转移5W PCR产物至一新的PCR板 中 ，加 Exo-SAP-IT，37°C孵 育 lh 。 4. 80°C孵育 15min 使 Exo-SAP-IT 失活。 5 . 在一 96孔板中设置两个APOE SN P位点的延伸反应(20jul体系） ： 244bp PCR 产物(第 4 步）7 4 ; 扩 增 S N P 的寡核苷酸引物(APOE112或 APOE158) 50pmol; IOX缓 冲 液 24;
AcycloTerminator 混合物 Ijul; AcycloPol DNA 聚合酶 〇.〇5jLil。 6. PCR参数： 起始步骤 ： 2min 95°C (变性） X 个循环： 15s 95°C (变性） 30s 55°C (退火） 最终步骤 ： 2min 15°C (冷却） X=APOE112为 3 0 个 循 环 ，APOE158为 6 0 个 循 环 。 7. 4°C 150g 离心。 8. 96孔板突光偏振检测设备上检测。 备选方案3 S N a P sh o t分析法检测A P O E 基因型 SNaPshot分析法所用的引物不同于基本方案所用的引物，因为该方案来自不同的实 验室。 材料(标V 的条目参见附录1) 溶解于T E 缓冲液(pH7. 4,附录1)的 3〜Sng/jul gDNA(来自血液） APOE引物： 前向引物^-CCA AGG AGC TGC AGG CGG CGC A-3' 反向引物:5^GCC CCG GCC TGG TAG ACT GCC A-3' 100mmol/L 4dNTP 混合物(Roche;每 dNTP 浓度为 25mmol/L) 5U/pl Taq 酶(Roche) 二甲基亚砜(DMSO) 含 15mmol/L MgCU9 IOXPCR缓冲液(Roche) QiaQuick DNA 纯化试剂盒(Qiagen) 测序引物： 5’-CGG ACA TGG AGG ACG TG^ ( APOE112) 5’-TTT TTT TTT TCC GAT GAC CTG CAG AAG-3'(APOE158) SNaPshot 混合物(包括突光标记[F]ddNTP;Applied Biosystems) 牛小肠喊性憐酸酶(Calf intestinal phosphatase， CIP; New England Biolabs) DNA ladder(GeneScan-120LIZ,Applied Biosystems) Hi-Di 甲醜胺（ Applied Biosystems) 96 孔板或 384 孔板（ MJ Research) 75°C水浴箱 ABI PRISM 3100 测序仪（ Applied Biosystems) GeneMapper 2.0 或 GeneScan 软件（ Applied Biosystems) I .在 96孔板或384孔板中准备PCR扩增体系(25jul体系） ： g D N A (用 3〜5ng/jul gDNA) 30〜450ng; APOE前向引物4pmol;
APOE反向引物I .4pmol; 各 dNTP 5nmol; T a q 酶 0. 5U ; DMSO至终浓度10%(VA〇; 含 I .5mmol/L MgCl2的 I XPCR 缓冲液。 2. PCR参数。 起始步骤： IOmin 94°C (变性) 35个循环 30s 94°C (变性) 30s 60°C (退火) 30s 72°C (延伸) 最终步骤： IOmin 72°C (延伸) 3. 用 QiaQuick D N A 纯化试剂盒去除多余的d N T P 和引物。 4. 在 96孔板或384孔板中准备测序扩增体系（ IOjlJ 体系） ： 217bp P C R 产物(第 3 步）Ijul; 测序引物(A P O E 112或 A P O E 158) 2p m 〇 l; 10 X 缓冲液2^1; SNaPshot 混合物 5 4 。 5. 扩增参数： 25个循环: IOs 96°C (变性） 5s 50°C (退火） 30s 60°C (延伸） 6. 为减少未结合[F ] d d N T P 的干扰，扩增产物中加2. 5jul C I P ，于 37°C孵 育 lh。 7. 75°C水 浴 15min使 CIP失活。 8. 加入D N A Ladder和 HI-DI甲酰胺于SNaPshot产物中，并 于 ABI PR I S M 3100测序 仪上扫描。 9. 用 GeneMapper 2. 0 或 GeneScan软件鉴定和确认A P O E 的基因型。 96孔板荧光偏振检测设备上检测。

来源：丁香实验

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