经验分享｜动物活体光学成像实验——荧光成像（三）【毛发】
博鹭腾生物
随着药物的发现和开发，动物活体光学成像，如生物发光成像（BLI）和荧光成像（FLI），被用于研究各种疾病过程中细胞和分子事件的发生。其中，C57BL/6 小鼠是转基因小鼠建模的首选，但由于它们的毛发颜色较深，成像前需要通过剃毛或化学脱毛来去除毛发，以便最大限度地收集信号。然而，脱毛会破坏正常的毛发生长周期，导致皮肤色素沉着的变化。C57BL/6 毛发生长周期由三个阶段组成：静止期，皮肤为淡粉色；活跃期，皮肤变为深灰色或黑色；成熟期，毛发停止生长，皮肤过渡回静止期，恢复为淡粉色。
皮肤色素沉着是生物发光成像中的一个重要变量，在纵向研究的实验设计和实施中应该考虑到该变量，特别是当需要对弱信号变化或动物之间的差异研究时。由于黑色素的吸收系数随波长的增加而降低，黑色素对较短波长（即在可见光谱中）的光的吸收作用比在近红外波长的光对更强。荧光成像可以使用近红外染料，它们具有较长波长的发射光谱，使它们对黑色素吸收的敏感性较低。然而，生物发光成像并不具备这个优势。萤火虫荧光素酶的发射峰约为 560 nm，使生物发光信号从与其相互作用的组织产生显著的散射和吸收效应，进而改变了从动物身上产生的信号的强度和分布，并最终被探测器成像。黑色素的存在不仅使皮肤看起来更深，而且由于其高吸收系数，被认为是生物组织中吸收光的主要来源之一。
5周内小鼠生物发光成像的结果图
(Curtis A, Calabro K, Galarneau JR, Bigio IJ, Krucker T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol Imaging Biol. 2011 Dec;13(6):1114-23. )
上图为一项涉及 C57BL/6 转基因小鼠的为期5周的生物发光成像研究。实验发现，在研究的第 3 周，色素沉着显著增加，在第 5 周恢复到基本水平。在这种情况下，在不同时间点收集的数据是不具有可比性的，因为信号受到不同程度的衰减的影响。与通过无色素沉着的皮肤发出的信号相比，通过黑色素沉着的皮肤发出的信号平均减少了 90%。
皮肤覆盖前后的成像对比图
(Curtis A, Calabro K, Galarneau JR, Bigio IJ, Krucker T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Mol Imaging Biol. 2011 Dec;13(6):1114-23. )
上图为另一个实验，把色素沉着的皮肤覆盖在信号光源上，强烈着色的皮肤会导致生物发光信号衰减 90%，这显然会导致显著的实验误差。
应对方法：
- 小动物活体光学成像中，需要在成像前对动物进行剃毛或脱毛；
- 荧光成像中，尽可能选用近红外染料；
- 将 C57BL/6 小鼠与 C57 白化小鼠进行繁殖，产生不再有深棕色皮毛的后代;
- 选用 AniView Kirin，该仪器采用的是透射光源，激发光穿透能力更强，从而提高荧光检测的灵敏度。
