经验分享｜动物活体光学成像实验——荧光成像（四）【染料推荐】

荧光成像被广泛应用于生物学的各个方面，允许可视化的细胞和亚细胞生物过程的空间分辨率范围从纳米（nm）到厘米（cm）。动物体内荧光成像已成为临床前工作中最常用的检测手段之一。在考虑体内荧光成像在生物学研究中的应用时，研究人员应注意其内在的局限性。在某种程度上，这些限制与光与组织微观成分的相互作用有关。如：界面反射、散射、吸收和自发荧光等。体内荧光成像中，组织散射和吸收可以显著影响荧光团的测量光谱。

组织散射：

当整个动物被激发光照射或透射时，在激发光进入动物体和荧光团发射光的过程中经历了多次散射事件。这将会导致在荧光图像中出现信号模糊的情况，这种情况对于远离激发光源和探测器（CCD）的荧光目标会被放大。散射的另一个重要结果是，它放大了组织荧光团的波长变化，导致检测到的荧光光谱的形状和峰值位置根据组织中光所走过的路径长度而变化。

组织吸收：

组织内的微观成分从小分子（糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、离子、水等）和大分子（蛋白质、磷脂、RNA、DNA、多糖等）到更大的结构（如细胞器和细胞膜等）通过可见光波长范围（400-700 nm）时，因为组织成分在这个波长范围内的吸收限制，削弱了有效光的穿透。然而，在红外或近红外波长范围内的光可以探测到更大的深度，其中主要的组织吸收器是脱氧血红蛋白，氧合血红蛋白，水和脂质。血红蛋白是一种强吸收剂，特别是在 500-600 nm 之间的波长区域。

1mm 血氧合血红蛋白（红）和脱氧血红蛋白（蓝）对光的吸收光谱

(Guosong Hong,Alexander L. Antaris,Hongjie Dai.Near-infrared fluorophores for biomedical imaging.)

自发荧光：

在活组织中存在着各种各样的分子，它们可以作为自身荧光的生物来源。当探针是弱荧光或稀疏分布时，来自感兴趣的分子探针的荧光信号可能被破坏。其中，动物的大部分自身荧光源自皮肤和结肠。

界面反射：

由于组织和空气是不同的介质，所以入射光会在界面产生反射，可以减弱激发光和发射光的强度。

综上，光的波长越短，散射越强，吸收越大，自发荧光越高，穿透深度越浅。由于以上因素的综合影响，导致荧光发射的强度比入射辐射的强度小 1000 倍左右。因此，建议荧光成像使用近红外荧光染料，它们具有较长波长的光谱，使其对信号衰减的敏感性较低。

荧光染料波长选择参考：

此外，利用荧光蛋白（FPs）对哺乳动物进行成像也是定量、无创跟踪肿瘤生长和转移、基因表达、血管生成和细菌感染的重要手段。来自绿色荧光蛋白家族（GFP-like FPs）的传统 FPs 的深层组织可视化受到血红蛋白和皮肤黑色素的高吸光度的阻碍。体内成像的最佳 FP 的最佳激发和发射波长应该在大约 650 nm 到 900 nm，该区间的组织吸光度最低。与 GFP 相比，由于其发射向红外光谱移位，在小鼠模型中，近红外荧光蛋白（iRFP）具有更高的亮度、光稳定性和信噪比。iRFP 在细胞内不仅稳定性高、毒性低，而且不需要添加底物，最佳的激发和发射波长为 690nm 和 713 nm。

建议：在选择荧光蛋白作为荧光探针时，可考虑使用近红外荧光蛋白。针对可见光成像，可选用 AniView 100、AniView Kirin 和 AniView Phoenix 等。针对近红外二区成像，可选用 AniView 30F 和 AniView Phoenix 等。