人外周血单细胞悬液制备流程及注意事项

人外周血单细胞悬液制备流程

1. 1.采集人外周血样本于抗凝管中。
2. 离心管内加入100 μL新鲜血和2 mL 1×红细胞裂解液，混匀，4℃裂解10 min。
3. 300 g离心5 min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃上清，得到白色细胞沉淀。
4. PBS洗涤一次。

加入100 μL细胞染色缓冲液重悬细胞，不用计数，即可进行后续流式抗体染色实验。按照100 μL新鲜血样本制备的单细胞悬液，加入1 Test对应的流式抗体混匀进行后续实验。

注意事项：

1. 采血用抗凝管，有肝素和EDTA两种。若直接裂解红细胞进行表面指标染色实验，两种抗凝管都可使用；如果是采血后检测细胞因子，则必须使用肝素抗凝。

2. 裂解液推荐使用10× ACK Lysis Buffer（E-CK-A105），不含固定剂。

3.10× ACK Lysis Buffer实验前需用纯水稀释成1×，现配现用，推荐放在4℃条件下暂存，当天使用。

4. 检测人外周血中常规指标，可用过夜保存的样本，一般来说问题不大。但是对于表达量比较低的指标，建议用新鲜的样本检测。

5. 第三步裂解完后离心弃上清时，建议用移液枪轻轻吸走残液。如果直接倒掉，离心管内会有残留裂解液，后续加入100 μL PBS重悬细胞时，可能不能完全稀释裂解液，导致红细胞裂解过度。

6. 细胞沉淀重悬，可用枪轻轻吹打，或者用转速小的涡旋仪涡旋。

7. 人血样本建议染CD45，有利于后续数据分析时圈门。

8. 处理人血样本时，推荐设置只染CD45的单染管低速上机用来设置阈值，观察细胞量，圈淋巴细胞群。

9. 人外周血中主要含T淋巴细胞，B淋巴细胞的量较少。如果使用病人的血液样本，B淋巴细胞的量可能更少，因此B淋巴细胞的检测不推荐使用过夜的样本，过夜样本易导致检测信号低。