小鼠骨髓单细胞悬液制备流程及注意事项

小鼠骨髓单细胞悬液制备流程

1. 颈椎脱臼法处死小鼠，放在75%酒精中浸泡5 min。提前于超净台上准备一个消毒托盘（可用无菌口罩或者用浸满酒精的纱布代替），取出小鼠并铺于消毒托盘上。
2. 在无菌环境下取小鼠的后肢骨。用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开，并分离两下肢的皮肤。将皮肤往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，游离出小鼠的两条后肢。
3. 小心剥离肌肉（肌肉两端的白色坚韧组织为肌腱，可以顺着肌腱分离，肌肉主要靠肌腱与关节相连），分别剪下Femurs（股骨）和Tibias（胫骨），剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意在该过程中应保留尽可能多的骨髓腔。
4. 拿一支1 mL的无菌注射器，吸取1 mL PBS，轻轻插入骨髓腔，冲洗骨髓腔以获得骨髓。重复2~3次，可冲出绝大部分细胞。冲洗完后，用移液器轻轻吹打细胞，将细胞团吹散。
5. 将冲洗液用200目的滤网过滤，滤液收集于15 mL离心管中，300 g离心5 min，弃上清。
6. 用细胞染色缓冲液重悬细胞，细胞计数，并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

注意事项：

骨髓样本细胞分群明显，可以裂解红细胞，也可不裂解。如需裂解红细胞，可以加入1~2 mL（视细胞沉淀的量而定）1×红细胞裂解液，轻轻吹散细胞，室温静置 2 min。再加 10 mL PBS终止裂解，300 g离心5 min。